作者soom ()
看板Biotech
標題[心得] 以Real-time PCR偵測 microRNA
時間Wed Nov 21 15:54:03 2007
最近花了一點時間在測試matured miRNA的PCR偵測法
有點心得可以跟大家分享
由於miRNA是只有23~27 nt大小的RNA片段
無法直接使用一般PCR去偵測,所以必須要想辦法將之延長
常見的作法是接上linker或者使用特殊的RT primer
我們Lab試過的方法有兩大種,都包括Kit以及後來自行modified的方法
第一種是先將RNA用Poly A polymerase加上oligo(A)
然後用加上linker的oligo(dT)RT primer做fisrt-strand synthesis
如此做出的cDNA大致上會到80~90 nt
之後就可以使用matured miRNA的sequence當作forward primer
(當然,U要用T代替),Linker上面的sequence當作reverse primer
就可以進行SYBR green I based 的qPCR
這種方法的Kit 可以參考I廠的 nCode
第二種是使用特殊的stem-loop RT primer
此RT primer全長約50 nt,前面6 nt需要和目標miRNA互補,後面則形成stem-loop的結構
這樣子產出的cDNA是約~75 nt
可以使用位於stem-loop中間偏後位置當reverse primer
miRNA扣除末5 nt的sequence當作forward primer
也是一樣可以進行SYBR green I based的qPCR
而若是需要probe,可以取miRNA跟RT primer間的sequence
這種方法的Kit請參考A廠的Taqman assay
把各種方法特點表列如下
第一種 | 第二種 |
poly A required x
RT-primer universal specific
F primer specific specific
R primer universal universal
使用時的感覺,若是使用primary tumor cell
則會發現第一種方法的melt curve非常混亂
但是stem loop法就比較單純的單一波峰,做出來的SD也比較小
若把kit也考慮進來的話大致上用起來的感覺是
(註: 此為本人使用心得,不一定具代表性)
優 >>>>>>>> 劣
價格 I廠 <= 1 < 2 << A廠
SD A廠 < 2 < 1 = I廠
時間 A廠 <= 2 < 1 = I廠
偵測能力 A廠 = 2 >>> 1 = I廠
C/P值 2 > A廠 > I廠 > 1
若是預算不用考慮的話,A廠會是省時間的好選擇
若是有時間設計primer的話 2 可能是比較好的選擇
以上所述 歡迎多多指教鞭笞
若是有需要RT primer的sequence可以再找我
參考資料:
1.
http://www.protocol-online.org/biology-forums/posts/16271.html
2. Caifu Chen, Nucleic Acids Research, 2005, Vol. 33, No. 20 e179
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◆ From: 140.129.77.155
推 HIbaby:m一下 11/21 17:20
推 boxiaokai:第一種方法RT的時候 可以在oligo-dT的3'端加上兩三個mer 11/21 20:01
→ boxiaokai:的dN 這樣使PCR的產物為固定長度 11/21 20:03
→ boxiaokai:能夠減少melting curve混亂的現象 11/21 20:04
推 fungo:很詳細!A跟2有better specificity的優點 11/22 05:59
→ fungo:但相對的因為RT就是用miRNA specific的primer 11/22 06:01
→ fungo:所以出來的cDNA產物也不能像I或是1可以用來偵測其他miR 11/22 06:01
推 soom:其實我用1去測的時候CT都接近undetectble,但改用2可拉到~25 11/22 15:53
推 soom:所以我才會比較推2跟A 因為用1如果測不到也是白搭呀.. 11/22 15:55