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大家好,我想要求救,因為我PCR怎樣都出不來快被老闆追殺了。。。 因為想show一些圖和條件給大家參考,所以有把目前幾次PCR結果貼在網誌上 網誌圖文版:http://hshinyi.pixnet.net/blog/post/24927108 希望大家能給我一點意見。 ---------------------以下全都從網誌來的 只有文字沒有圖------------------------- 我先前有去NCBI做electronic PCR 測試設計的primer專一性 至少目前看起來這對Primer確實可以夾出我要的geneX, 而且專一性高,在genome database裡沒有其他hit。 在genome上的這段序列是high GC content 所以gradient PCR中間的annealing step 我用比較高的溫度 結果失敗。沒有東西。 然後我又另外加了betaine(5M) 1 uL DMSO濃度不變 只有1% Gradient PCR範圍拉大 從55~67度 結果只有前面大約55~58左右有PCR產物出現 可是卻沒有我要的PCR產物 (大小約463bp) 後來我突然想到來PTT找看看有沒有人有這問題 搜尋文章後發現先前有人建議 若GC比例高(60~70%) DMSO濃度可以升高到7.5~10% 然後我就試了這個條件 結果還是失敗 整塊膠超乾淨的 只看到marker跑的超漂亮...=___=" (救命啊~) ---------------------------------------------------------------------------- * 最亮那條marker是500bp * PCR program: 1. 95'c, 10min 2. 95'c, 45sec 55~67'c, 1min 72'c, 30sec (29cycles) 3. 72'c, 10min 4. 4'c, 10min *Taq和dNTP還有Genomic DNA理論上都沒有壞 因為跑其他組Primer都沒有問題。 ---------------------------------------------------------------------------- 如果有人可以給我建議 請問我現在應該更改什麼條件會比較好? 改DMSO濃度? 改Betaine濃度? 改PCR條件? 拜託各位幫忙了~ 謝謝。 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 163.25.118.180
jademan:cycle=29 不覺得太短嗎? 不如cycle內時間短些,cycle數長些 02/23 11:26
kirby0415:DNA 1ul的濃度是多少? 02/23 11:51
hshinyi:genomic DNA濃度約50ng/uL 02/23 11:52
nixo:用什麼酵素? 02/23 12:25
yaliu:第一個step為什麼要設到95度10分鐘?很長耶這個時間 02/23 12:33
yaliu:應該94度5分鐘就夠了吧...denature我只設94~貌似有聽過太高 02/23 12:35
yaliu:溫會加速Taq半衰期之類的.... 02/23 12:35
hshinyi:酵素是Fermentas的Dream Taq 02/23 12:39
conective:總體積作20μL 第一個step 94度 5分鐘 試試看 02/23 13:56
conective:DMSO 5% 02/23 13:56
hshinyi:樓上,那要加betaine嗎? 02/23 21:55
lulusa:以你的長度95度不需要那麼久 dntp看起來有點少 02/23 23:56
lulusa:annealing的溫度可以從50度開始試 先有主band再說 02/23 23:58
lulusa:有主band出現 再來調鎂離子濃度(一開始的鎂要用最低去試) 02/24 00:00
nixo:建議換專為高GC狀況使用的酵素,和其他實驗室借或索取樣品 02/24 03:44
icome:finnzyme的phusion DNA pol有GC-rich專用的buffer 可試試 02/24 09:43
hshinyi:我使用的Buffer裡面已經有含Mg 不需要外加耶... 02/24 11:09
gerpy:betain可以試著再增加到反應濃度為1-1.5M間。 02/24 17:05
gerpy:betaine 02/24 17:06
solomo:可以同時試看看其他酵素 KAPA ROBUST 02/24 20:22
licat:我會試兩三種不同家的酵素 annealing溫度降低到50 02/24 21:27
licat:出不來的話直接重新設計一對primer 不要與上一對的座落位置 02/24 21:28
licat:有重疊到 然後再跑PCR... 加油~ 02/24 21:29
rivor:好像我同學做的耶...是昆X嗎..呵 02/26 10:46
hshinyi:樓上 我想我不是你同學耶... 03/02 01:30