作者xareelee (XareeLee)
看板Biotech
標題[求救] Transfer 200 kDa的protein 效果很差
時間Mon Feb 7 21:06:38 2011
我們實驗室之前都是用semi-dry的方式 但是200 kDa常常transfer效率不好
semi-dry的條件:
gel: 7.5% acrylamide gel (thickness: 1 mm)
buffer: 20% methondal, 192 mM Glycine, 25 mM Tris (沒調整pH,但應在8附近)
current: 280 mA
duration: 30 min
membrane: NC membrane (pore size: 0.45 micron)
試過把methanol降為10% 結果也是一樣！
我們是用Cell Signaling Technology (CST)的biotinylated marker (#7727)做測試
http://www.cellsignal.com/products/7727.html
140 kDa的marker勉強壓得出來 但是200 kD就幾乎看不到
就算壓到30分鐘也是幾乎沒有
後來改用wet transfer (GenePure system)
gel、membrane和buffer的條件一樣
但是current改用300/350/400 mA且duration測試1/2/3 hr的交叉測試
都完全沒有辦法壓出明顯的200 kDa
10% methonal也測過了
也試過增加0.05% SDS到trnafer buffer內
效果都不佳
現在要壓western看 200 kDa的target完全不敢做
因為連marker都壓不出來
做下去只是浪費時間和抗體....
想問一下有沒有人做過>200 kDa的western blot
能夠提供您的tranfer條件
謝謝！
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◆ From: 111.82.62.18
順便問一下大家的gel和NC membrane會泡在transfer buffer內多久呢？
※ 編輯: xareelee 來自: 111.82.62.18 (02/07 21:14)
→ aborwang:時間拉久一點，先試1.5倍時間看看，protein在膜上其實很 02/08 01:22
→ aborwang:難被transfer過頭。另外，泡在buffer內5~30分鐘 02/08 01:24
→ aborwang:NC membrane和PVDF適合的protein也不一樣，構造原理不同 02/08 01:38
→ chvkimo:我是有試過濕式 transfer over-night, 30V 4度C 02/08 06:00
→ chvkimo:fermentas 的marker 250kD 可以, 不過我的target還是測 02/08 06:01
→ chvkimo:不到 , 所以只能給你參考看看囉 02/08 06:01
推 icome:用濕式 加0.1% SDS 02/08 08:24
推 leoblack:200 kD的protein最好用wet transfer 02/08 10:49
推 FENOR:我transfer過400kD的，當時是直接卯起來transfer四小時 02/08 11:18
→ FENOR:不過我的membrane是PVDF的 02/08 11:19
→ FENOR:而且電流我也只用了80mA 02/08 11:19
推 henrywang:我的protein 450 kD, wet transfer with 0.2% SDS 02/08 16:03
→ henrywang:50 V(定電壓) 999 min 冷房操作 02/08 16:05
→ rimeni:200kD: Towbin buffer, 0 or 10% MeOH, no SDS, 30V 16hr 02/09 12:32
→ rimeni:OR 100V 120min OR 40V 750min; 請參考 02/09 12:34
→ Danielle:改濕式的 很有幫助 02/09 13:20
→ keeny:請用supersignal Femto ECL reagents 保證一定做出來 03/07 01:47