推 Ianthegood:推! 04/03 09:36
※ 引述《boblu (六百)》之銘言:
: 要搞懂還是弄一套 molecular cloning 來看看比較好
推這本是cloning聖經,有問題先看一下通常就會有解答
: ※ 引述《Johnpolo (隱行)》之銘言:
: : 想請問一下 我現在抽完RNA 然後是不是要轉cDNA才能ligation
: : 那是要用什麼方法 是用一般PCR 還是RT-PCR
(以下恕刪)
RT-PCR一般指的是reverse transcriptase PCR
real-time PCR的簡寫則是qPCR RT-qPCR qrt-PCR或是 kinetic PCR
兩者很容易混淆
一般要從RNA做cloning的確是要先轉成cDNA再做PCR以產生大量雙股DNA
接著看是要直接用限制酶切還是先用TA cloning都可以
個人比較建議先做TA cloning,因為可以先定序,
之後也可以不用每次都還要做PCR,又要擔心產物會不會有變異
然後真的有不用ligation的cloning法
1. in vivo cloning
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC310636/
直接把線狀的PCR產物跟載體一起送進特定的大腸桿菌株
它自己會用homologous recombination幫你做
2. ligation independent clongng (LIC)
http://bitesizebio.com/2008/02/18/ligation-independent-cloning-primer-design/
這是用特殊的primer設計,讓載體跟PCR產物能形成可互補的序列
除了這兩個好像還有很多種設計就是了
但我想J板友應該要去跟實驗室的學長姊討論以確定實驗設計
不會就當場問到會,覺得奇怪就立刻問到了解
畢竟板友不是你們實驗室的,無法幫忙隔空抓藥
祝 實驗順利
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