[討論] 定序後找不到cutting site序列

[maurice9325 (水色天秤)]

各位早，想與各位討論一個cloning後奇怪的情況。

1. 目的是從A plasmid 把 A insert 以XhoI/XbaI切下來，置換B insert。

A plasmid的 sequence 不清楚 （沒有map)，只知道經由雙切、gel extraction後約為6k
。

B insert sequence是知道的，以PCR amplification。頭尾設計有cutting site sequenc
e，PCR product同樣以gel extraction回收，雙切後再回收一次，約3.2k。

回收後的vector與insert進行Ligation，並有挑到一個候選的colony。

2. Clone後的plasmid以下述方法確認：

2.1 以XhoI/XbaI雙切確認，確實可以得到3.2k 與 6 k的sequence。

2.2 以BamHI單切可以得到得到300多bp 的band (insert中本來就帶有兩個BamHI的切位，
且確實會掉出300bp片段)。

2.3 以PCR夾確實也可以得到3.2k的band。

因此我就把這個Clone送定序了。

3. 定序時有以B insert序列合成5條Primer，分別如下：
Primer 1: 500 bp 處往回夾
primer 2: 400 bp 往後夾
primer 3: 1100 bp 往後夾
Primer 4: 1800 bp 往後夾
Primer 5: 2500 bp 往後夾

但是定序結果出現了奇怪的問題，也是相與各位討論的點。

比對結果發現
1.insert的序列完全沒錯。
2.但是insert 前後，vector的序列都不是XhoI/XbaI的序列。

那為何雙切確認時還切得出來。
這個plasmid有可能發生什麼事情嗎，或有可能是定序的問題。

請各位提供意見與看法，謝謝。




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→ xxtomnyxx: 基本上，這種問題沒提供手上的資料，包含質體序列和定
→ xxtomnyxx: 序的結果等等，沒資料基本上是不用討論的，但是可能牽
→ xxtomnyxx: 涉到研究內容所以不方便公開，所以......只能自己想囉
→ maurice9325: 謝謝樓上，我也想知道質體序列，但就是沒有提供。 因
→ maurice9325: 可能鋪陳太長，就其實只是想問cutting site的sequenc
→ maurice9325: e沒看到覺得很奇怪。
→ blence: 結果在你的primer1,5的圖檔裡,跟你的backbone知不知道無關
→ blence: 圖檔是你的研究內容,這個有公開的疑慮
→ ganbaba: 從vector 前後夾回來就知道了阿，基本上定序500bp以後都
→ ganbaba: 有可能不准了
→ Ice9: 你有看過 primer1,5兩個都圖檔嗎？ 是清楚的還是混亂的？
→ Ice9: 另外，不知道質體的情況就敢硬幹 下去，你們很有勇氣吔
→ ad1980: 把原本的 plasmid A 拿去定序，看看 plasmid sequence 是
→ ad1980: 什麼，cutting site 有沒有對，insert A 是不是對的，都
→ ad1980: 對了以後再繼續。
推 ad1980: 可以在 insert 裡面設計兩個 primers 往外面定序，確認 Xb
→ ad1980: aI/XhoI site，順便確認 vector sequence。
推 mollyapple: 定序primer再重新設計夾A多一點試試看