→ jjlee: 這是一個很重要，但10年後才有正確資料依循的問題，目前各 02/11 15:12
→ jjlee: 大資料庫有的是以 “最常被文獻用到的 exon" or "所有的CD 02/11 15:12
→ jjlee: S exon+最長的utr exon" 連接, 或者兩者混合. 定義為 sel 02/11 15:12
→ jjlee: ect or canonical transcript. 02/11 15:12
→ jjlee: 基本上，會越來越趨向用 2nd or 3rd NGS 的定序資料來定義 02/11 15:14
探討transcript是更深入的層次，我想問的沒那麼重要啦
而且不同transcript往往差在前後UTR
只要保有相同的cds就無礙於平常的cDNA cloning
但是當透過transfect外表現一個基因來探討有/無改變什麼現象時
使用的cds差異或許wild type/full lengt會變成mutantion/truncation了
→ xxtomnyxx: 我覺得考慮哪一個是「全長」是沒有意義的，重點應該在 02/11 18:57
→ xxtomnyxx: 於你的研究是什麼？假如你想探討的是一個基因在特定的 02/11 18:58
→ xxtomnyxx: 時期(發育或成年)特定組織中的功能，那你只要拿該組織 02/11 18:59
→ xxtomnyxx: 樣本的 cDNA 做 cloning，得到的 isoform 就是你要的「 02/11 19:00
→ xxtomnyxx: 全長」了，如果這個基因已經有很多已知 isoform，就在 02/11 19:00
→ xxtomnyxx: paper 中寫明 clone 到的是哪一個 isoform 就好了，如 02/11 19:01
→ xxtomnyxx: 果樣本中同時有 2 種甚至以上的 isoform 被表現，就要 02/11 19:02
→ xxtomnyxx: 看是否有某一種 isoform 占大多數，甚至可以把有表現 02/11 19:03
→ xxtomnyxx: 的都 clone 下來做分析，還可以探討 isoform 是否分別 02/11 19:04
→ xxtomnyxx: 具有不同的功能 02/11 19:04
是呀，目前是都先紀錄是哪個NCBI accession number
主要是看到作者會在M&M提到"全長"的clone，尤其跟自己的長不一樣時
總會猜想是不是有什麼常用的判別方式
至於探討各別isoform就偏離方向了，還是留給有興趣的人做
喔對了，要挑哪個isoform也可能在設計primer的階段就決定了
運氣不好的話得換過幾組primer才能成功
→ Ice9: 細胞株、實驗條件不同，得到的clone有時候就不一樣。我們的 02/12 09:01
→ Ice9: 經驗是看到不一樣就從splice site看合不合理，沒問題就不同 02/12 09:01
→ Ice9: clones都拿下去做驗證。 02/12 09:01
→ Ice9: 早期會用Northern blot看可能的isoforms及表現量做決定 02/12 09:09
→ Ice9: 現在是看大家拿哪個就做哪個，除非有其他考量。 02/12 09:11
以前的確會這樣，透過site-direct修改成paper用到的isoform
→ Ice9: isoforms這種東西真的很看運氣，要探討的基因倒霉的話就有 02/12 09:19
→ Ice9: 成千上萬個isoforms，又或是readthrough transcripts。 02/12 09:19
→ jjlee: 大概再五年，就能便宜的進行第三代 FL-cDNA/RNA 定序. Clo 02/12 10:52
→ jjlee: ning之前先把 target gene有哪些 expressed isoforms, 且 02/12 10:52
→ jjlee: 這些 isoforms 個別的表現高低都能知道，屆時再合成出對應 02/12 10:52
→ jjlee: 量的 FL isoform clones 進行實驗. BTW, Tp53 是一個同時 02/12 10:52
是指每次用isoforms pool取代單一clone做transfection嗎？
這不太可能吧，相對量無法輕易的透過表現數個clone還原出來
不過若用表現量最高這個原則，我也比較偏好如此
目前我的做法是從GTEx找出表現量最高transcript後去cloning
因此難免遇到跟NCBI認定最長的FL isoform有差異
後來也出現了與paper上提到的序列不一致的問題
這就是最大的顧慮
→ jjlee: 間有許多 isoforms 進行蛋白質表達的基因, 現在很多的 RNA 02/12 10:52
→ jjlee: 研究都忽略這個重要因素. 02/12 10:52
※ 編輯: blence (118.233.138.244 臺灣), 02/12/2022 18:20:25
→ xxtomnyxx: 通常要 clone 一個基因時，我設計 primer 會以 NCBI 02/12 19:56
→ xxtomnyxx: ref-seq 中編號最小，或位數最少的 NP sequence 為準， 02/12 19:57
→ xxtomnyxx: 另外，與其用 isoform pool，我到寧願用 piggybac 直接 02/12 19:58
→ xxtomnyxx: 送 gene locus 進去讓細胞自己決定要表現哪些 isoform 02/12 19:58
→ xxtomnyxx: #送用constitutive promoter 或 inducible promoter 02/12 20:02
→ xxtomnyxx: drive 的基因 locus 02/12 20:02
推 jjlee: “NCBI認定最長的FL“ 沒有考慮到組織/細胞表現特異性，原 02/12 20:30
→ jjlee: Po用GTEx會比Refeq select isoform更合理 02/12 20:30
→ blence: 沒錯,若參考的NCBI序列沒P出來,不一定是技術問題 02/14 00:27
→ blence: 就像上面說的情況,這時換掉primer或換細胞就好了 02/14 00:28
推 michaelhsien: 試試看 CRISPR activation？(dCas9-SAM) 02/17 00:15
→ jjlee: CRISPR activation 啟動了內生性基因，但 target isoform 02/18 12:16
→ jjlee: 是否能產生是個問號，直接塞一個剪好的較直接 02/18 12:16
→ blence: CRISPRa/i也是要cloning,該面對的isoform還是避不掉 02/18 14:22
→ blence: 況且cDNA cloning增加表現只是功能之一,另有更多實驗目的 02/18 14:26
→ xxtomnyxx: micha版友的意思應該是不使用 vector 表現，而改用 02/18 14:49
→ xxtomnyxx: CRISPR activation 去起動基因表現，由組基或細胞自己 02/18 14:50
→ xxtomnyxx: 本身擁有的機制決定要表現哪些 isoform。不過這樣只能 02/18 14:51
→ xxtomnyxx: 解決 alternative exon 的 isoform，遇到 alternative 02/18 14:51
→ xxtomnyxx: TSS 的 isoform 也是不知道要啟動哪一個就是了 02/18 14:52
→ xxtomnyxx: 啟動 組織 02/18 14:52
→ xxtomnyxx: 不過這方法也怪怪的，樣本細胞本身就不表現這個基因， 02/18 14:53
→ xxtomnyxx: 做出來的 isoform 到底具有什麼意義實在很難回答 02/18 14:55
→ jjlee: 這倒是一個有趣的issue, 感覺會出現很多種可能 02/18 17:52