[方法] 請問flow做cell cycle 細胞shift分析

[maurice9325 (水色天秤)]

如題，最近新接觸一個藥物，加入細胞後24hr再以flow分析cell cycle。

試驗流程如下：
1.Seeding 5*10^4/well in 12 well plate.
2.Drug-treated for 24hr.
3.1x Trypsin then collect cell, PBS wash 3 times.
4. 70% EtOH fix for 24 hr at -20 degrees Celsius.
5.PBS wash 3 times.
6.Staining with 20 ug/mL PI, 30ug/mL RNAse, 0.1% TritonX100 at RT 30 min.
7.Flow.

結果因藥物影響，造成細胞shift，導致control為基準進行gatting時，結果落差太大，
與實際情形不符。

如附圖，以control為基準拉出4個phase，但可看到處理組因shift，S-phase吃到G0/G1-p
hase導致百分比上升，但這個上升是不符合實際情形的。

https://i.imgur.com/iyFMJRA.jpg
https://i.imgur.com/4tiD9Hj.jpg

因此想請問各位因應這種情形會如何分析。

或有什麼改善方法可以方便提供參考，謝謝。



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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 49.216.131.178 (臺灣)
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1655863741.A.05A.html
→ xxtomnyxx: 我猜你的藥物會留在細胞內並影響PI染色的螢光
目前也不清楚，但確實由其他實驗推測會影響DNA replication。
推 cjsntu: 直接調整加藥組的G0/G1 peak回到跟control一樣的位置 不過
→ cjsntu: 要看老闆 有的老師可以接受有的就不行
感謝回覆。調整peak可能不太行，因為如果範圍比較小，例如S-phase怕會有誤差，老闆
可能不接受。另外就是如果是多濃度/多組別，若每個都要手動，同時得紀錄百分比，這
個做法可能不切實際。
※ 編輯: maurice9325 (49.216.131.178 臺灣), 06/22/2022 21:03:05
※ 編輯: maurice9325 (49.216.131.178 臺灣), 06/22/2022 21:04:27
→ xxtomnyxx: Peak shift 的程度有和給予的藥物濃度正相關嗎？
看不出正相關，只知道一定濃度以上即會導致shift。有懷疑過是否與藥物處理後pheboty
pe改變所以導致shift，但無法確定。
推 bahrimank: 如果以螢光強度，手動定義G0/G1;S;G2 phase呢?
有想過，但如同上述，如果每次實驗組別太多，會花太多時間在後端分析與記錄。且曾經
遇過reviewer挑戰，以此方法不夠客觀，調整不同組別參數以分析自己想要的data也不符
合flow的精神。
推 MartianIT: 藥物的MOA是?
因為是新藥開發與測試，所以沒有結論。目前就知道會影響DNA的function，如上述DNA r
eplication；而最後一定可以想像細胞就是死了。

另外回覆我們曾經有與專員討論過，例如：
前段的部分，固定細胞數量後再fix and staining但無效。

或上機時以不同電壓微調再收data，但此方法同收完以後再調整有相同的問題，就是一樣
組別太多無法操作且不太客觀。

或是輸出raw image利用第三方軟體把shift的位置拉回來疊一起，再進行area的計算，但
我目前沒有找到相關軟體可以分析。

所以想請問是否有大大有類似的分析經驗、或方法上的改善。謝謝。
※ 編輯: maurice9325 (49.216.131.178 臺灣), 06/23/2022 07:51:21
→ xxtomnyxx: 既然知道會影響 DNA function，合理假設他會與 DNA 結
→ xxtomnyxx: 合，藥物分子經常有很多環可以共振，也就有可能會有螢
→ xxtomnyxx: 光的性質，我會猜訊號會偏移應該是藥物分子的影響，試
→ xxtomnyxx: 試看換其他種 cell cycle analysis 染劑，或者是在 fix
→ xxtomnyxx: 後染 PI 前將所有組別的細胞都用藥物處理讓他們都有相
→ xxtomnyxx: 同的偏移看看(不過藥物如果量少又貴就不能這樣用)
推 darrenyo: 試試看DAPI或hoechst? 還可以不用加RNase
推 cjsntu: 突然想到PI用到80-100 ug/mL peak shift狀況會好很多 我
→ cjsntu: 碩班也遇到類似的困擾過 濃度調整之後就有比較好
好的，感謝諸位，我會試試看。另若有其他大大另有不同處理/分析方法，仍請不吝提供
。謝謝。
※ 編輯: maurice9325 (49.216.131.178 臺灣), 06/24/2022 10:04:41
推 hkaiwei: 要注意每組染色細胞數有沒有因為藥物處理而改變，會影響
→ hkaiwei: 最後PI的強度