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如題,最近新接觸一個藥物,加入細胞後24hr再以flow分析cell cycle。 試驗流程如下: 1.Seeding 5*10^4/well in 12 well plate. 2.Drug-treated for 24hr. 3.1x Trypsin then collect cell, PBS wash 3 times. 4. 70% EtOH fix for 24 hr at -20 degrees Celsius. 5.PBS wash 3 times. 6.Staining with 20 ug/mL PI, 30ug/mL RNAse, 0.1% TritonX100 at RT 30 min. 7.Flow. 結果因藥物影響,造成細胞shift,導致control為基準進行gatting時,結果落差太大, 與實際情形不符。 如附圖,以control為基準拉出4個phase,但可看到處理組因shift,S-phase吃到G0/G1-p hase導致百分比上升,但這個上升是不符合實際情形的。 https://i.imgur.com/iyFMJRA.jpg
https://i.imgur.com/4tiD9Hj.jpg
因此想請問各位因應這種情形會如何分析。 或有什麼改善方法可以方便提供參考,謝謝。 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 49.216.131.178 (臺灣) ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1655863741.A.05A.html
xxtomnyxx: 我猜你的藥物會留在細胞內並影響PI染色的螢光06/22 17:45
目前也不清楚,但確實由其他實驗推測會影響DNA replication。
cjsntu: 直接調整加藥組的G0/G1 peak回到跟control一樣的位置 不過06/22 20:04
cjsntu: 要看老闆 有的老師可以接受有的就不行06/22 20:04
感謝回覆。調整peak可能不太行,因為如果範圍比較小,例如S-phase怕會有誤差,老闆 可能不接受。另外就是如果是多濃度/多組別,若每個都要手動,同時得紀錄百分比,這 個做法可能不切實際。 ※ 編輯: maurice9325 (49.216.131.178 臺灣), 06/22/2022 21:03:05 ※ 編輯: maurice9325 (49.216.131.178 臺灣), 06/22/2022 21:04:27
xxtomnyxx: Peak shift 的程度有和給予的藥物濃度正相關嗎?06/22 22:06
看不出正相關,只知道一定濃度以上即會導致shift。有懷疑過是否與藥物處理後pheboty pe改變所以導致shift,但無法確定。
bahrimank: 如果以螢光強度,手動定義G0/G1;S;G2 phase呢?06/22 23:40
有想過,但如同上述,如果每次實驗組別太多,會花太多時間在後端分析與記錄。且曾經 遇過reviewer挑戰,以此方法不夠客觀,調整不同組別參數以分析自己想要的data也不符 合flow的精神。
MartianIT: 藥物的MOA是?06/23 00:27
因為是新藥開發與測試,所以沒有結論。目前就知道會影響DNA的function,如上述DNA r eplication;而最後一定可以想像細胞就是死了。 另外回覆我們曾經有與專員討論過,例如: 前段的部分,固定細胞數量後再fix and staining但無效。 或上機時以不同電壓微調再收data,但此方法同收完以後再調整有相同的問題,就是一樣 組別太多無法操作且不太客觀。 或是輸出raw image利用第三方軟體把shift的位置拉回來疊一起,再進行area的計算,但 我目前沒有找到相關軟體可以分析。 所以想請問是否有大大有類似的分析經驗、或方法上的改善。謝謝。 ※ 編輯: maurice9325 (49.216.131.178 臺灣), 06/23/2022 07:51:21
xxtomnyxx: 既然知道會影響 DNA function,合理假設他會與 DNA 結 06/23 11:37
xxtomnyxx: 合,藥物分子經常有很多環可以共振,也就有可能會有螢 06/23 11:38
xxtomnyxx: 光的性質,我會猜訊號會偏移應該是藥物分子的影響,試06/23 11:39
xxtomnyxx: 試看換其他種 cell cycle analysis 染劑,或者是在 fix 06/23 11:40
xxtomnyxx: 後染 PI 前將所有組別的細胞都用藥物處理讓他們都有相 06/23 11:41
xxtomnyxx: 同的偏移看看(不過藥物如果量少又貴就不能這樣用) 06/23 11:42
darrenyo: 試試看DAPI或hoechst? 還可以不用加RNase06/23 12:51
cjsntu: 突然想到PI用到80-100 ug/mL peak shift狀況會好很多 我 06/23 21:57
cjsntu: 碩班也遇到類似的困擾過 濃度調整之後就有比較好 06/23 21:57
好的,感謝諸位,我會試試看。另若有其他大大另有不同處理/分析方法,仍請不吝提供 。謝謝。 ※ 編輯: maurice9325 (49.216.131.178 臺灣), 06/24/2022 10:04:41
hkaiwei: 要注意每組染色細胞數有沒有因為藥物處理而改變,會影響 07/29 18:26
hkaiwei: 最後PI的強度 07/29 18:26