Re: [新聞] 研究造假 一句「資料丟了」就卸責？

[Shilia (us, together)]

: 推 ggg12345: Illumina的那篇文章裡提到ATCG合成時,也可能出錯,聚合酶  11/20 21:27
: → ggg12345: 會改正解開,交大的實驗是因為Mg稀釋到很低,所以不發生這  11/20 21:35
: → ggg12345: 種過度快速反應,所以沒量出錯配再解開的導電波形嗎?      11/20 21:37
: 推 jabari: Pol會不會作錯跟他心情有關..改正跟Klenow有關 Mg只是動力  11/21 00:12
: 推 ggg12345: 請問那個Mg最後跑到那去了?是否有其他代用品?            11/21 02:26


  老師，之前講的是簡單版 (想說您不是做蛋白質結構的)

  PCR 反應中，鎂離子的作用主要是 dNTP-Mg 與核酸骨架相互作用，並且催化聚合酶。
  看圖比較容易懂: http://www.jbc.org/content/274/25/17395/F3.expansion.html

  詳細版的聚合酶作用步驟可以參考 Critical role of magnesium ions in DNA
  polymerase beta's closing and active site assembly 這篇 2004 年 paper 的最
  末段 ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15238001 )，就可以看到 PCR 反應
  過程為什麼緩衝液中一定要有鎂離子（濃度一般會在 0.5-5mM 之間。<1.5mM 產量會
  降低，>2.5mM 會開始出現 nonspecific 的結果，>10mM 會抑制聚合酶作用。)

   Taken together, we suggest the following sequence in pol beta's reaction
   pathway for correct nucleotide insertion: (1) binding of the dNTP/Mg2+
   association to the pol beta/DNA in an open state; (2) binding of the
   catalytic Mg2+ to the active site; (3) relatively fast conformational
   transition from an open to a closed state involving subtle residue
   motions; (4) slow, and possibly rate-limiting, assembly of the key amino
   acid residues, template bases, Mg2+ ions, and the primer 3’-OH; (5) slow
   and possibly rate-limiting chemical step of the nucleotidyl transfer
   reaction; (6) release of the catalytic Mg2+; (7) relatively fast
   conformational transition from the closed to open complex state again
   involving subtle residue motions; (8) release of the product PPi/Mg2+
   unit. Steps 1 and 2 may be interchangeable depending on which Mg2+ first
   binds to the polymerase/DNA active site.

  不管接上去的是對的還錯的 dNTP (帶負電)，都需要鎂離子幫忙穩定雙股 DNA。看圖
  還是比較容易懂：http://goo.gl/93VMFd 只是接到對的 dNTP 整個 DNA 聚合體能量
  會比較穩定、接到錯的 dNTP 整個 DNA 聚合體能量會比較不穩定，可參考 2008 年這
  篇 Mismatched and matched dNTP incorporation by DNA polymerase beta proceed
  via analogous kinetic pathways 第 11 圖: http://goo.gl/DaoVF1

  所以我個人對 Fig.S7 將 10mM 的鎂離子稀釋 10**6 倍後才會出現的量測圖形的看法，
  傾向於那是機器的背景值 (← 就像示波器或 UPLC 開機就一定會有背景值一樣)，因
  為鎂離子濃度這麼低的情況下，聚合酶應該也不太活動了。

  老師您如果很喜歡這個定序概念，請看一下 Nature Nanotechnology 在 2007 年就已
  出刊的 Sequence-specific detection of individual DNA polymerase complexes
  in real time using a nanopore. UC Santa Cruz 這團隊用同樣的技術一直持續產出
  paper，到現在。

  交大團隊還 UC Santa Cruz 團隊的實驗數據可信，時間會說話。


  最後，生物體內有很多很多酵素，需要鎂當催化劑的並不只有 PCR 反應的聚合酶。
  "有沒有其他替代物" 這問題，雖然我沒辦法做任何結構生物學實驗，不過根據土法煉
  鋼自己配 buffer 一個一個試的結果：鋅、銅、錳、鈣、鎳、鐵好像都 OK (← 就實
  驗室裡找得到什麼會被 EDTA 無效掉的東西就拿去配 buffer 跑跑 PCR 測試一下)

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推 jabari: 推你有耐心Q_Q UC聖誕公公只有示意圖 交大是眼見為憑耶QwQ
推 EagleSoul: Mark Akeson group 在這field做的很早也很猛
→ MasterChang: g大是資工背景的....講那麼專業他懂嗎？
推 lingon: 全都試看看, 佩服
推 tainanuser: 推!
→ Shilia: M大：想要跟對岸一樣做出自己的次世代定序平台，本來就需
→ Shilia: 要懂硬體極限和軟體可以如何補強的人啊
推 lingon: 中國的平台...? 主要還是靠買CG的技術吧, 好像還沒看到
→ lingon: 任何可以期待的平台
→ Shilia: http://goo.gl/WRosDJ [Bio-IT World] China Introduces
→ Shilia: Its Own Sequencer (May 29, 2014)
推 jabari: 對岸請不期不待.. 開發是SOAP的作者群都消失了 一整個問號
→ Shilia: 台灣嚴重的內鬥才真令人不期不待吧