作者 satyricon (每朵玫瑰皆有刺...) 看板 Biology
標題 有人做過>1KB的TOPO TA Cloning嗎？
時間 Sat Jul 12 14:31:19 2003
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小弟用invitrogen的TOPO TA CLONING 已經近三年，
一向都很容易clone我要的東西，
最近在clone幾段超過1kb的PCR時，竟然都做不出來，
有2.7kb,2.3kb和1.1kb，沒有一個接的進去pCR II或pCR4 vector，
每次都有colonies，但是都沒有正確的insert，
我的insert都有做gel-purification，
我改了一些條件，例如把heat shock的時間增長等等都沒有用，
我自己和實驗室老師朋友想的到都有調整過，就是不行，
跟invitrogen聯絡，確定這兩個vector的insert都到3kb，所以理論上應該可以，
他們建議我減少insert的量，除此之外似乎也沒有其他建議，
不知道有沒有人有這方面經驗願意分享一下，謝謝！
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標 題: Re: 有人做過>1KB的TOPO TA Cloning嗎？
發信站: ☆清華電機☆ (Fri Jul 18 22:46:39 2003)
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1. PCR增加final extension的時間。30-60 min，增加A incorpation的機會。
2. 可能有exonuclease再buffer或micro-centrifugation tube或tips中，所有的
物品都進行滅菌，尤其是liagtion的tube和使用的tips。
3. 另外就是ligation的問題，就按照一般的ligation trouble shooting處理之。
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標 題: Re: 有人做過>1KB的TOPO TA Cloning嗎？
發信站: 不良牛牧場 (Sun Aug 10 13:48:32 2003)
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I use T4 ligase for ligation at 16℃ for 16 hr.
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標 題: Re: 有人做過>1KB的TOPO TA Cloning嗎？
發信站: ☆清華電機☆ (Mon Aug 11 15:53:07 2003)
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construct的plasmid太大，calcium chloride transformation的方法送到E.Coli
的效率太低，建議使用electroporation的方法送。
每plasmid能一次insert的大小約為plasmid的最大長度約plasmid的1/2左右，不論
如何，多做幾個不同insert/vector比例的ligation看看。
或者那些vector的T已經掉光了？
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標 題: Re: 有人做過>1KB的TOPO TA Cloning嗎？
發信站: 成大生物飛翔站 (Wed Aug 13 13:34:36 2003)
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沒有colony可能是competent cell有問題. 換別家或是別種competent cell
試試看. heat shock的方法, 我都用來送>14k的plasmid, 應該不會有問題.
益生公司的EOS101很好用, 可以試試看.
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作者 shrimp (Brahms) 看板 Biology
標題 Re: 有人做過>1KB的TOPO TA Cloning嗎？
時間 Wed Aug 13 14:59:09 2003
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那麼我覺得應是ligation的問題
之前，您有提到檢查ligation後的產物，但那也只能表示ligase有作用
但別忘了，vector+insert若不形成circular form
那還是不會被E. coli所replicate, 是吧！？
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作者 genome (Genome) 看板 BCT
標題 Re: 有人做過>1KB的TOPO TA Cloning嗎？
時間 Mon Jul 14 06:02:23 2003
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我是用過這TOPO TA cloning成功clone過2.1 kb insert
不過這insert(PCR product)我只通過QIAGEN Gel purification kit
就是把PCR product + QC solution直接通colume 沒有做gel purification
要不 乾脆改用TOPO XL TA cloning kit
我試過7.8 kb insert成功
如果花錢能解決的話 就再買一個這kit 比TOPO TA cloning貴不了多少
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作者 Linena (闇己) 站內 BCT
標題 Re: 有人做過>1KB的TOPO TA Cloning嗎？
時間 Wed Jul 16 09:32:23 2003
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基本上kit的TA vector是不會有問題的
問題應該是出在insert部分
本實驗室的做法是gel purification後,會取5ul純化產物 進行所謂的"A tailing"
做法是加dATP to final conc. 0.2mM
PCR buffer
2.5U Taq polymerase
至總體積20ul(其餘體積補水),72度反應30分鐘
這樣可以讓PCR產物末端儘量加上A 以利於TA cloning
不過,也有可能是你PCR產物的末端序列是Taq polymerase不喜歡加上A的序列
這會造成很難得到正確的TA clone (我個人就有遇過這情形)
若是單純是這個原因,transformation結果應該只有10顆以下的白色colonies
然而看你的描述似乎transformation又獲得很多白色colonies
並非得不到colony (若是得不到,我會建議調整ligation比例)
這暗示你的PCR產物裡有不知名的plasmid污染物
因為就transformation efficiency而言
plasmid較ligated DNA容易有transformants
這能解釋為何你會獲得一堆PCR不出產物的colonies
而且我推測你一直都未曾抽取過那些colonies的plasmid做酵素截切的檢查
所以更是無法剔出我所提出的有不明plasmid污染的可能性
因此建議你一定要抽plasmid用酵素切了跑膠看pattern然後找出污染的原因
會比你盲目改PCR條件或是調整ligation的vector,insert比列來的有意義
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作者 genome (Genome) 看板 BCT
標題 Re: 有人做過>1KB的TOPO TA Cloning嗎？
時間 Thu Aug 14 03:35:56 2003
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我是這樣想啦:
若Vector (4-5 kb):Insert (<1 kb) = 1:3
則Vector (3 kb):Insert (8 kb) = 3:1 應該不算太誇張
所以 我做過的這個ligation後來是在 6:1和12:1 接起來的
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『要用輕盈的腳步，跨過生命中沉重的事！』
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