Re: [問題]關於抽質體DNA的問題

[KLAHA (Scars of sabbath)]

※ 引述《citrinin (anticitrinin)》之銘言：
: ※ 引述《wwwjjj (......)》之銘言：
: : 在下是剛進實驗室的新手
: : 目前還是大學生
: : 想請問各位大大
: : 抽plasmid DNA的步驟中
: : 在加入各種buffor,靜置..........
: : 之後有一個步驟:離心後取澄清液
: : 上面的解釋說此澄清液含有plasmid DNA
: : 而沉澱物則包含了genomic DNA, proteins, cell debris, SDS ...
: : 我想請問的是genomic DNA不是細菌除了plasmid外的DNA
: : 兩者同樣是DNA只是大小.形狀的不同
: : 為什麼plasmid DNA會溶解而genomic DNA卻會沉澱下來
: : 不知道這樣形容會不會很模糊
: : thank you:)))
: 一個牛津大學的博士告訴我是被 protein 給'絞'進去的

聽你說法應該是用alkaline lysis

離下菌,去掉broth

soln 1 : GTE
菌的等張液,維持菌的完好
務必使菌完全懸浮

加soln 2：SDS和NaOH
SDS=detergent,破菌
NaOH=使DNA變性(denature),由雙股打開為單股型式
混勻即可,切勿劇烈混合使genome DNA斷裂


加soln 3：加酸(我用醋酸鉀)
中合soln2,務必混合均勻
此時plasmid DNA因片段較短,馬上renature
但genome DNA片段較大,不及馬上renature

離心,捨去懸浮(lipid)&沉澱物(protein,genome DNA等),取出液體

加入100% EtOH沉澱,離心

去除上清液(有genome DNA)
留pellet=plasmid DNA

以70% EtOH wash　

乾燥後得plasmid DNA,
溶於適量水或TE buffer內

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◆ From: 61.222.64.102
→ enisx:不用過phenol/chloroform ?
→ KLAHA:技巧高超的如我學姐不必過 *笑* 我有時要
→ isotoper:能請問樓上是大學還是研究生嗎?
→ KLAHA:碩一 XD
→ isotoper:難怪有背~~好恐怖喔>_<"
→ eyespot:solnII,III加完才離心吧?
→ agbug:實驗不用背啦,看步驟做就好,原理比較重要
→ HXZ:做久的自然都會記起來
→ zerpher:應該是plasmid 在PH12.0-12.5不denature吧
※ 編輯: KLAHA           來自: 140.112.234.180      (02/19 13:24)