推 shaline:建議你先確定作western時用的anti-TCF Ab的epitope是否 03/21 13:59
→ shaline:落在N端delection的位置；再者，dnTCF可能有表現，或許有 03/21 14:01
→ shaline:function，但也會造成wtTCF dominant negative，導致TCF 03/21 14:04
→ shaline:在western中無法被detect到。 03/21 14:05
我的實驗是做Wnt pathway
簡單的說～就是想辦法讓Wnt pathway on or off
然後去看他的下游gene的expression
目前為止～activate Wnt pathway都沒有問題
有問題的是inhibit
我使用的材料是dnTCF
TCF是Wnt pathway下游的一個transcription repressor
這個construct是跟別的實驗室要的
問題來了
在test的時候就發現我的dnTCF不work
於是就做了transfection跑western看他protein有沒有表現
跟wild type比較的結果
western幾乎沒有表現～（意思就是wtTCF表現很多）
這當中老師懷疑是我transfection的問題
於是我co-transfect了GFP當作internal control
在照相的時候發現GFP的亮度有變
老師又懷疑是我照相的問題
於是我心一橫
又做了一次co-transfection with GFP
分別拿去跑flow和做IF
發現其實transfection efficiency都差不多
可是在wtTCF和dnTCF中
GFP的螢光減弱很多（無論是flow或是IF都是這樣的結果）
而在IF的結果中
dnTCF幾乎沒有表現
所以問題有幾個
1.到底為什麼我的dnTCF不會表現？？
我要到的construct是delete掉N-terminal 93個amino acid
而我查paper一般用的dnTCF的construct是delete N-terminal 31或33個amino acid
但是我去查了TCF的 structure
即使delete掉前面93個amino acid應該是不會影響他的function才對
所以我一直不知道為什麼我的dnTCF不表現
2.在wtTCF中看到GFP的螢光亮度減弱是可以理解的
因為TCF是transcription repressor
有可能因此抑制了GFP的表現
重點就在於～這個現象在dnTCF裡面也有看到！
如果dnTCF不會表現，它怎麼去影響GFP的expression？？
（我有做另一個control是transfect plasmid 的backbone但沒有任何gene
發現GFP的expression很亮～所以wtTCF和dnTCF相較之下變弱很多）
請版上高手幫忙解答吧
我已經搞這個搞了很久
弄得很挫折
希望大家可以一起討論～
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