作者nidus (咕嘰)
看板Biology
標題<求救>lipofectamine 效率
時間Sun Oct 5 22:49:17 2008
請問有人用過嗎？？
我做了好幾次效率低到看不到想要表現的protein
我的步驟如下：
genaid抽plasmid 再以酒精沈澱進一步純化
使用細胞為hela
transfect 前一天在六公分盤種9X10五次方細胞
第二天取500λserum free DMEM 與 3μg plasmid混和
20λlipofectamine與500λserum free DMEM混和 等五分鐘
將上述兩溶液混和 等20分鐘
將混合液倒入昨天seeding好的HeLa cell 六公分盤中
HeLa cell 六公分盤會先以PBS wash兩次 以將serum洗掉
六小時候再將medium置換成有serum的DMEM
24小時候收細胞 western檢測
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plasmid有提高至8μg 結果還是一樣
plasmid也有digest後跑膠 位置也對
只不過我欲表現的protein 並不是一個完整的protein
完整序列有276aa 而我只有取1~120
請問有沒有可能是無法folding而被進一步degrate掉？？
以上希望有大大相助 任何建議都好
謝謝
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◆ From: 125.225.133.107
※ nidus:轉錄至看板 Biotech 10/05 23:30
推 vixen:1.你怎麼抽plasmid的? 2.丟個GFP plasmid做控制組 10/06 12:39
推 abc0:lipofectamine+DMEM與plasmid+DMEM是怎樣混合的?請仔細說一下 10/06 12:44
→ nidus:全照genaid protocol抽 10/06 15:40
→ nidus:其實有做過只有EGFP的 結果他有表現 而且還蠻多的 10/06 15:40
推 wchienkai:那看來不是 transfection efficiency 的問題了 10/06 15:55
推 humwang:transfection前是否先把細胞放到antibiotics free medium 10/06 20:32
→ humwang:transfection時是不是在antibiotics free medium? 10/06 20:32