protein-protein interaction--Tap-tagging

[niolas (要如何能值得?)]

先暫做簡介,以後有空在上來po詳細方法:
Tap-tagging全名為Tandem Affinity Expression Purification,
一種很有效率的純化方法,順便可以釣出protein complex,
對於未知與其他蛋白作用的特定蛋白,這是個好方法,
而且純化出來的蛋白純~

策略為:

1.在Target protein的C-terminal加上CBP(calmodulin binding protein),
  再來是TEV site(可被TEV protease切斷),再來是protein A三個Tag的fusion protein,
  用PCR放大此片段後(兩邊要有Target gene的部分片段做recombinent,有一種特殊的
  plasmid叫pBS1479與pBS1539專門做這種方法),transform入yeast(我用Saccharomyces
  Cerevisiae modified strain)。
2.篩出菌後養大破菌,以超高速離心(不同蛋白不同條件)後取上清,跑含IgG的column,其
  目的為和Target protein最尾端的protein A結合,流洗完後拿TEV protease下column
  ,這時會發生什麼事大家很清楚,出來的液體只有Target protein和TEV protease與
  少部分non-specific protein。(由於protein A和IgG結合力非常強)
3.再拿此流洗液下第二道column,含Calmodulin beads(內含Ca2+離子),這時大家也知道
  會發生什麼事,就只有含calmodulin binding protein的Target protein會binding
  上column,再用Native elution即可。

出來的蛋白很純而且不破壞蛋白在cell裡和其他protein interaction的結果,
這個方法之前都是free的,網路上可以察到全部的方法,前陣子又要用時才發現
設計的人跑去開生技公司,然後這個方法變成一套產品。
下面的網站有詳細的做法,有興趣的就參考看看囉!
http://www-db.embl-heidelberg.de/jss/servlet/de.embl.bk.wwwTools.GroupLeftEMBL/ExternalInfo/seraphin/TAPtagging.html


※ 引述《HIbaby (嗨北鼻)》之銘言：
: 我都用ip啦 同實驗室的學長 有人用GST 有人用yeast two hybrid
: 不過我不知道 你說的物化方法是哪些 可以舉個例嗎
: 印象中 有用生物趕測器的方式 來測蛋白質和受體間的結合力
: 當結合以後 會有微電極產生
: 可以比較精確測得binding的強弱
: 這算物化法嗎? 如果你有興趣 我再找相關paper給你看
: ※ 引述《baseguard (....NN             )》之銘言：
: : 各位在做研究時,測試protein-protein interaction 大概都是用什麼方法?
: : yeast two-hybrid, GST(or orther tags) pull-down ,IP ...
: : 這些我都用過...帶給我很大的困擾..各有各的麻煩
: : 似乎有人用比較物化的方式,可不可以分享看看?
: : FRET?
: : isothermal titration ?
: : 因為本身都是用分生的做法
: : 希望一窺物化　生化領域的朋友的觀點

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推 baseguard:大感激!這個版實在太棒
推 niolas:拋磚引玉~希望大家也都熱心點popo心得囉^^