Re: [請問]濃縮protein的方法?

[timbrian (perk yourself up)]

※ 引述《paraheamly (一了百了 是我現在的心情)》之銘言：
: ※ 引述《SPEman (speman)》之銘言：
: :      收完 cell lysate之後準備跑 western blot,
: :      卻發現lysis buffer加太多,導致蛋白質濃度太低而無法load gel,
: :      所以勢必要濃縮protein才能繼續做下去...
: :      學長跟我說有些實驗室的人會用加熱法來濃縮protein
: :      好像是在50~60度左右,將裝protein的tube蓋子掀開來煮,使水蒸發掉,
: :      只是不知道該煮多久呢?
: :      不知道煮太久會不會傷害protein呢?
: :      (另外,用95度煮可不可以呢? peptide是共價鍵應該不會因此打斷吧?)
: :      請問板上有人作過類似的實驗嗎?
: :      不知道能不能分享你們濃縮protein的方法呢?
: :      謝謝各位了^^
:   95度加熱 peptide band是不會斷，但會因氫鍵斷掉而恢復一級結構，露出疏水端
: 當再回到冰上這時hydrophobic force，會使得protein相互凝集而沈澱，無論妳用哪種
: 濃度測定法，測出的值一定不準確。若你的蛋白質耐熱度高至50～60度，則可以用加熱
: 但必須要用離心將部分已沈澱的蛋白取出，只保留上清液亦可。
:   一般濃縮，會採用超薄膜濃縮，若是小體積的，可用millipore的centricon(有更新一代
: 的，我忘了他的名字)，過濾膜10KDa以上，再以離心力將多餘的水分去除，5ml可濃縮至
: 200ul。大體積，如：100ml~300ml則可用stirred cell，或hollow fiber進行濃縮，
: 若沒錢，但已知蛋白質的疏水性極高，可用硫酸銨沈澱後，透析或loading desalt
: column。
:                                                        GOOD LUCK


  1. 加熱或是抽乾是個方法 但無法去鹽 假使鹽過高 會造成跑的很醜
  2. 如果只是要loading gel check protein, 用 centricon 太貴(約兩百到四百元)
     不合乎成本
  3. 用硫酸胺沉澱後透析 太花時間. 用acetone 沉澱 會loss 掉一些protein

  我的解決方式 自製centricon..
  把你的sample 取約 50uL 放到 eppandrof 的蓋子的凹槽
  上面加個透析膜 (約1平方公分)  蓋緊

  約 3000rpm 離心個數分鐘到數十分鐘 即可濃縮 又不太貴
  出來後的體積約 10uL 剛好夠你跑電泳

  不過操作時手要細點





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◆ From: 203.204.140.176
推 hyellow:這招真是太神了！
推 questionaire:佩服佩服啊!!
推 ptthamutaro:拜服  m(_"_)m
推 zzxxzz:請問這樣可以濾掉鹽嗎？
推 apa9394:有要申請專利出kit嗎?~~~
推 wensing:拜!!!!
推 ghjkl:神
推 HIbaby:神 受小弟一拜 m(_ _)m
推 HIbaby:忍不住再推~
推 HIbaby:good job~
推 hchs890843:好厲害~~~上次我也有看到實驗室學長做
推 Bluecold:偷學....太強了
推 youngcrazy:再拜
推 leisurestone:拜+1
推 biolenz:真的神..試試看..