推 intotheman:對的 確保clone片段夠清潔 02/28 20:10
推 dreamcity:我就是這樣做的....gel elution時TAE乾淨與否有關係嗎? 03/03 13:23
※ 引述《intotheman (花草盒子)》之銘言：
: ※ 引述《dreamcity (飛行在宇宙中的航海者號)》之銘言：
: : 各位好,小的是一個小碩一,
: : 我有兩個基因片段要clone起來做定序,
: : 但是這兩個都不太小,一個2.8K,另一個3K.
: : 我用實驗室裡的cloning Kit試過好幾次了,一直失敗.
: : 老師也一直說不要亂做浪費錢(他X的我完全照protocol.....)
: : 請問各位有什麼好方法幫幫我吧!!
: : 另外再請教,做完transformation後把plate放O/N,
: : 隔天看plate上滿滿的都是菌落,代表什麼意思?
: : 要一個一個挑起來篩選嗎?
: : PS:
: : Cloning system:
: : 1. GeneMark pOSI-T Cloning Kit, 用的是Kit附的勝任細胞.
: : 2. TOPO TA Cloning Kit(PCR-II cloning vector), 用的是實驗室的勝任細胞(DH5α)
: sorry 你說的要先clone定序，是說只要訂這兩個片段嗎?
是的
: 如果是的話，直接用rtTH做PCR片段，再用Topo做藍白篩選，再用vector上的primer去定序
: 不過接近3K大小的片段，不好送進vector裡面，記得要將transformation完的
: 菌液離下來全塗到盤上(IPTG/X-Gal)再挑白色的起來check吧
: 如果是要做subcloning接上去的話,請愛用gel-extration kit確保DNA片段的清潔
請問subcloning是指用degenerate primer做PCR後,切下所要的片段大小的gel,
經過gel elution後做cloning嗎?
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