→ a64toto:請問t牌應該是takara吧,可是我不知道N牌的是?? 04/29 23:23
推 blence:NEB吧? 04/29 23:35
※ 引述《a64toto (我)》之銘言：
: ※ [本文轉錄自 Biology 看板]
: 作者: a64toto (我) 看板: Biology
: 標題: [問題] 再請問一下ligation的問題
: 時間: Sat Apr 29 20:24:52 2006
: 之前在版上有看過一些相關的問題
: 可是還是有一些疑問想請教一下
: 我是使用Q牌的agarose gel extraction kit
: 在使用前與使用後都有跑agarose確認有band出來
: 可是在transform都沒有coloy長出來(接到pET 23a vector)
: 可是接到T vector的都有長出blue colony
藍白斑篩選,藍色是空載體,白色才是有插入片斷的
: 所以應該不是transform出問題囉
: 那要check ligation有沒有問題的話
: 好像positive control是放已經切好的vector是嗎?這樣一定會長出colony嗎?
: 還是我搞錯啦
: 還有如果拿10 ul的ligation mixture(已經16度O/N)直接跑agarose gel
: 這樣能看得出來有沒有接起來嗎?
看不出來的
連接效率很低的,所以連上的環狀質粒不可能看到
: 最後我染agarose gel的dye是SYBR不是EtBR,請問這樣會對ligation有影響嗎?
和你一樣的問題我也遇到過
後來改了一些條件就做出來了
一是，pET系列載體都是低拷貝的，得到的vector通常濃度較低，連接時要稍多加一些
二是，同樣是由于低拷貝的原因，培養基（無論固體還是液體）裡的抗生素要比平時減半
三是，在連pET系列載體時，T牌的ligase通常會比N牌的差蠻多
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◆ From: 202.127.20.27