推 wenpinn:推~ 我也想知道定量或濃縮的不同種方法... 05/02 02:51
→ wenpinn:有哪一種是針對thiol protein的方法嗎~? 謝謝謝 05/02 02:55
※ 引述《ntutmpmpm (睡著了??)》之銘言：
: sample以細菌細胞(E.coli)為主
: sample preparation的問題 在做TCA沉澱 加完lysis buffer即lysosome後
: 回溶率真的超級低的 放了頗久的時間pellet還是好大一塊
: 不曉得有經驗的前輩們是用什麼方式來解決回溶問題呢??
雖然是很久以前的問題....
不過最近的實驗遇到相同的瓶頸....
唯一不同的是使用的來源是CHOA (mammalian cell)
收下細胞後 會先通一個Sepharose 4B column將thiol group protein elute出
然後再接TCA沉澱
沉澱完就遇到相同的問題: pellet很難完全溶解
因此必須找方法 將沉澱之後用2D sample buffer回溶的protein extract進行定量
我們實驗室用的protein quantification方法是 Bradford法 (Bio-Rad protein assay)
但是實驗室的過來人說 用這種方法定量 若是sample中含有urea則會使background太高
因此必須找別的方法來定量
或者是以別的濃縮方法來取代TCA沉澱
不過.....
參考相關paper 發現明明也有人用同樣的方法
(TCA沉澱 再用含有urea的buffer回溶 後接Bio-Rad assay)
以下是paper裡提到的methods:
The protein pellets from the three protocols described
above were washed with ice-cold methanol followed by
multiple ice-cold acetone washes, dried in a flow of nitrogen
gas and redissolved in IEF buffer (0.7 M urea, 2.0 M thiourea,
4% CHAPS, 10 mM DTT, 1.0% w/v carrier ampholytes
pH 4–7 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)). Protein concentrations
were quantified using the Bio-Rad protein
assay (Bio-Rad) using BSA as a standard. We note that
the BSA concentration is overestimated by approximately
50% using this reagent, resulting in an equivalent reduction
in the protein loading of our samples (see manufacturer’s
handbook); however, this approach allowed normalization
of sample loading.
很冗長的問了一堆........>"""< 真是sorry拉 辛苦了大家的眼睛
想要知道 是不是有人也遇過跟我們一樣的問題呢...?
能不能請教一下高手們是如何解決這個瓶頸的...
是要相信paper裡說的 雖然Bio-Rad assay會有誤差 但還是照樣測
還是還有更好的方法.......??
或者是有更好用的precipitation / protein quantification方法?????
--
...And she was richer in those dreams than in realities;
for things seen pass away,
but the things that are unseen are eternal.
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.115.231.191