推 ROKEE:不同的Taq主要區別在於是由不同物種而來 05/02 19:01
→ ROKEE:一般DNAP合成DNA的速率大概30bp/sec，自己估算一下囉^^" 05/02 19:02
推 absentee:pfu的反應時間說明書上有寫 你可以去找找看 05/02 20:07
推 dorphilvet:我們的做法比較保守，以taq1分做1000bp來算，你可以 05/03 00:39
我是參考某篇 paper 的作法
產物從500bp~3kbp 都有
所使用的enzyme是 ampliTaq Gold polymerase
PCR program
95度 10min
95度 1min ___
55度 2min |45cycles
72度 2min ___|
72度 7min
所使用的 primer 經過軟體測試
Tm值大概是 57~60
我有跑 55 跟 60 度的 (annealing temp)
結果長片段的(1kbp以上)出不來或是雜band(而且還沒期望出現的band)
短片段的有些有出來有些出不來(或有雜band)
看文章說大片段的可以考慮用 pfu
我就去弄來用用看
所使用的 program 是
95度 5min
95度 1min ___
55度 2min |45cycles
72度 2min ___|
72度 7min
結果原本做出單一短片段的反應做出了雜 band(只挑一個出來對照)
大片段的產物都很奇怪(只有 8x~3xx bp)
因為我不太了解 pfu polymerase 的特性
不知道 program 是不是不適合
接下來可能考慮將 annealing 時間改短至 1min
extension 時間拉長到 3min
想請問各位的是有用過 pfu 或做過大片段產物的人
你們所使用的 program (如果是用 pfu) 大概是怎樣的呢?
如果不是用 pfu...那是用什麼呢?
還有我是不是忽略了什麼可以調整的地方?
提醒我一下
謝謝~
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