Re: [問題] Ligation失敗(已看過精華區)

[aggaci (有氣質的台客)]

※ 引述《ctlee (寧靜小城)》之銘言：
: 請問各位高手
: 小弟現在要將3kb的PCR product接到一6.4kb的vector的Bgl II上
: 我先PCR amplify我的fragment
: 純化後用Bgl II切再gel purify以去除nonspecific products
: 至於vector, 我用Bgl II 切完純化後用CIAP做dephosphorylation
: Ligation的時候insert:vector大約維持在5:1的比例
: 14 C overnight之後 transform到DH5alpha competent cells
: 奇怪的是,我的control(無insert)沒有任何colony
: 有insert的ligation 做transformation出來所得的clone全是self-ligation
: 我實在無法解釋這個結果,難道insert會促進self-ligation嗎
: clone這個fragment好幾個月了都沒什麼進展,拜託各位幫忙了

  pPCR product直接切可以
  以BglII來說，再primer設計上面得多延伸3個nucleotide才會比較好切

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  http://0rz.net/da0PG  我的相簿....

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 140.114.100.165
推 shaline:推~可以參考NEB catalog上有說明BglII切點多延伸GA或TC，
→ shaline:enzyme作用20小時可達>90% cleavage
推 yoknowme:也可以先接blunt end, 成功後送sequence看primer有沒有做
→ yoknowme:錯, 我有一次因為廠商primer做錯 而白花了好幾個月
推 chiasaiqueen:我也是。primer一堆deletion，做TA後才發現!
推 andrew4728:推primers出包,真的超無言
推 pj0611:可以問是哪幾家廠商嘛?...很怕我也....