Re: [問題]有關cloning 選用的tag

[shunze (畢典End=延畢Start)]

混搭Taq和pfu(或是其他具有proof reading的Taq)

PCR cycle<30

這樣做出來的PCR產就兼具正確及A的尾端

跑個電泳 確認產物大小及濃度

若有雜BAND就 回收預計片段 並濃縮

接在專門接PCR產物的載體即可(ex pGEM-T, pCRII-TOPO)

我比較偏好後者 因為時間只需5分鐘左右 室溫下即可完成



※ 引述《winjj (小深藍)》之銘言：
: 是Taq 不是Tag
: taq類都沒有proof reading 的功能
: 有proof reading功能的是pfu
: 但是pfu沒有會在PCR產物末端加上A的特性
: A要自己另外加上去
: 通常用taq類的話, 就是接上去後在定序確認啦
: ※ 引述《[e-mail] (MIMIMOMO毛毛和我)》之銘言：
: : 我是大學部菜鳥
: : 因為前一陣子用plantium tag、Extag做PCR得到我的產物
: : 與p-blue、PGEMT ligation
: : 但是藍白篩的結果白色菌落都沒有得到insert
: : 總共重複做了數十次依樣沒有結果
: : 現在boss叫我用violet試試看(我的vector是PGEMT easy vector)
: : 但是violet不是沒有proof reading的功能嗎
: : 這樣該如何做轉殖
: : 我有查過相關資訊，應該是如果insert有接近去後
: : 得到定序結果
: : 只有功能性的序列沒有問題就可以轉殖
: : 但是要如何確定他哪些是功能性的序列
: : 請教各位老手了~~
: : 感恩喔

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     天是藍的
         宇宙也是藍的
                        在這廣大的天地中
     誰能捍衛自己的明天
 看著旭日東昇

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 220.136.25.176
推 oplz:topo vector 很貴....
推 shunze:還好吧！只有買載體的話 20rxn約5000元
推 bystander945:都已經重複數十次了 應該沒差這點錢吧!?
推 oplz:我覺得普通的反應用到 topo-vector 真的是浪費錢....
推 interleukin:我也絕得用topo太浪費  錢不是這樣浪費的
推 shunze:研究都是趕時間的...尤其挑選基因時效率比較重要