Re: 請問關於EMSA的問題

[aggaci (有氣質的台客)]

※ 引述《aggaci (有氣質的台客)》之銘言：


   之前EMSA都用DIG做的
   後來因為一些問題改用isotope試試看

   結果有加nuclear extract的有shift出現
   但是後來以100x沒有label的、同樣的DNA去競爭(和probe一起反應)
   竟然沒辦法競爭掉?
   我加的nuclear extract有20 micro-gram
         DNA(garma-p32 labeled)  加 8 fmol
   30度 incubation 30 min

   好奇怪，有EMSA達人可以告訴我為什麼會這樣嗎?
   我覺得很不合理
   看paper 50x都可以競爭掉了，竟然100X不行?!



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※ 編輯: aggaci          來自: 140.114.100.165      (05/24 19:15)
推 apa9394:請問阿家西大大~你們DIG KIT是哪家的阿~
推 aggaci:ROCHE阿~~
推 erised:你有先把cold probe跟nuclear extracts先prebind嗎?
→ erised:我都是在室溫先prebind 30mins再加入hot probe室溫20-30min
推 ZecAhau:我是把 competitor 先跟 protein pre-bind 37度 10分鐘

  請問你(妳)們pre-binding時cold probe都是labeled probe的幾倍?
  有無做過neagative control呢?
  之前一直做不出來  火大了，pre-binding給他來個200倍
  結果是什麼都競爭掉了，連neagative control都競爭掉了(一定不會binding的那組)



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