[問題] 跪求silver stain染不起來的問題(補述)

[NightAmades (夜)]

我的protocol如下

1. Fix              50% MeOH, 12% AcOH add 0.154ml 24% H2CO/200mL in hood
incubate for more than 1 hour to overnight

2. Wash            50% MeOH       Wash 3X 20 minutes

3. Pretreat           0.02% Na2S2O3 thiosulfate solutions should be prepared
fresh, save some for step 7.
                   Incubate 1 minute exactly.

4.Rinse             ddH2O       3 times 20 seconds

5. Impregnate        0.2% AgNO3 Dilute 2 ml of 20% stock to 200ml, and add
0.231ml 24% H2CO
                   Incubate for 20 minutes, DON'T TOUCH GEL!!

6. Rinse            ddH2O     2 times 30 seconds

7. Develop          6% Na2CO3 (200ml)  add 0.154 ml 24% H2CO and 4 ml of
0.02% Na2S2O3
                   Incubate for 10 minutes

這幾天我一直試者找出原因...
再過程中也發生一些奇奇怪怪的事情...
首先在某一次...我染成功了!!
而那次我回想與之前有哪些地方不同..
唯一不同的是..我跑SDS-PAGE時用的running buffer不大一樣...
先前我run SDS的內槽用每次需新配的10X->1Xbuffer
而外槽用used buffer! 由於之前學長都是全用新的...
想說由此推測可能是這方面有問題....
而再下一次...我染的的時候...發生奇怪事情!
就是我染的第一片可以染...可是大概相距約一小時左右染第二片卻染不起來..
而這兩片在跑電泳的buffer不一樣!一個是用確定以前使buffer可以染的..
一個是新配的10X(因為10X用完)dillute成1X~
而由此兩次結果我就推測那應該是跑電泳的buffer問題!
因為這次我使用的是兩種同樣試劑和方法!!
but............
再隔天...我跟學長再做一次染色...
學長的gel是確定可以染的時候用的電泳buffer!
而我故意繼續使用我新配的..來跑電泳來染色(想說推測應該是buffer問題)
可是呢...結果竟然我的跟學長的gel都染不起來!!
而當日我再用BSA去跑電泳(buffer依然是我自己那罐新配的)去染色!
結果雖然有一點band出來...但是很淡...算是視同失敗...!!
以這情況來看...好像又不是buffer問題才對...
而且以常理來看buffer應該不會影響才對..!!
可是如果推敲是試劑問題...
那之前所發生的"第一片可以染..第二片不能染"的狀況又不知道做何解釋.......
而如果是試劑問題....我這種情況不知道是哪種世紀出問題的可能性比較大?
現在找資料...大家遇到的問題通常都是background染太深的問題..
好像幾乎沒看到像我這樣連染都染不到..
background都沒有...就跟剛跑完SDS-PAGE一樣透明......
唉~好難搞~
這次我把問題PO仔細點....
希望大家甚至有高手可以幫我想想解決~~~~>"<
感激不盡!!!

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 140.127.160.142
推 intotheman:你再用develope solution洗的時候有黃褐色出現嗎?
推 NightAmades:幾乎是沒有! 就一個很透明的一片....gel!~"~
推 intotheman:沒有!?那不就根本沒有銀在上面 你要不要換一下AgNO3?
→ intotheman:看看 不然你develope solution是新鮮配的嗎?
推 NightAmades:關鍵溶液step3.5.7都是做之前新鮮配的~
→ NightAmades:也不清楚會是哪個試劑出問題...畢竟有時候可以染!
→ NightAmades:而且...硝酸銀也是每次從stock新配..