[問題] His-tag的蛋白elute不太下來

[chococracker (巧克力餅乾)]

拜讀過前述蛋白表現相關文章
我是用BL21來表現human的His-tag蛋白
1mM IPTG在室溫表現三小時
結果也是大部分蛋白在pellet

後來sup的少量蛋白用1M imidazole 去elute下來之後發現resin上面還有很多蛋白
試過pH 4.5的改變電中性方式或高鹽或B-ME方式去elute都沒效
我懷疑蛋白根本就不只用His-tag去抓住Ni-resin
請問還有其他方式可以得到更多蛋白嗎？

另外我試用Takara的chaperone plasmid set去co-expression
是有讓sup的蛋白量變多了 但是elute下來的蛋白還含有少量洗不掉的chaperone
而且利用那些蛋白去做EMSA實驗發現會影響蛋白的binding能力

我找到一篇paper是關於去除chaperone的方式 http://myurl.com.tw/6qc2
還在考慮該不該花心力去試這個方法
不知道有沒有先進試過類似方法 可以提供意見 謝謝

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◆ From: 140.129.74.69
推 ROKEE:一般DNA binding protein可以試試看用heparin column
推 Bluecold:wash時加一點detergen or high salt 干擾Chaperone用
→ Bluecold:至於一直bind在resin上的protein 或許可加入少許EDTA
→ Bluecold:把Ni跟protein一起抓下來 再與Imidazole做dialysis
→ Bluecold:去除Ni 只是建議啦 應該是很濫的建議XD
推 longy:通常1M去elute不太可能不掉 請問你怎麼確定resin上還有蛋白?
推 aggaci:樓上的，這是有可能的！當局部蛋白質濃度太高時就會！
推 kokoko:一篇好文章  希望有用 http://0rz.net/361Oj
推 chococracker:請問dialysis時加一點點imidazole時可以去掉Ni嗎？
推 sezko:請問七樓...多少的濃度稱為太高呢...??