推 mandible:real-time28-30其實很高ㄟ!準嗎??是否有飽和現象?? 09/13 21:34
→ mandible:可看一下Melting Curve!判斷primer是否有dimer出現! 09/13 21:35
原本我的real-time一直都做的好好的
結果自從有一次跑出來的Ct值忽然很低
之前都在28-30之間
那一次突然變成20上下
我就把real-time的產物拿去跑膠看看是哪裡有問題
跑出來的結果發現產物竟然不是single band...
可是當初作real-time之前已經用一般的PCR去跑過
primer應該是沒問題的
當初跑出來也都呈現很乾淨也很sharp的single band
竟然好像在一夕之間都做不出來了
於是我就回到PCR，想開始逐步找出問題所在
我用的cDNA都是同一批
起初想說先提高annealing的溫度
後來怎麼提高都不見改善，想說問題也許在primer
沒想到今天把新的primer溶好後開始重P
竟然還是無法做出當初那樣的single band
又因為real-time需要一組internal control
本來閉著眼睛都做的出來的internal control
從那一次問題開始後也是無法出現single band
連今天換了新的primer也是一樣
唉......好無力....已經P了一個多月
每天晚上一想到第二天的實驗又做不出來
就覺得壓力好大...心情很不好
我做的是hTERT基因的表現
請問也有人在做這個的嗎?
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