[問題] cloning

[circleming (新世紀音樂)]

想請教各位一些經驗，
最近學姐叫我做一個cloning..
而她希望得到high fidelity...因此我們使用PFU進行PCR...
試了一些條件，
跑膠的結果得到大小類似的band...
但確定有東西，但是估計濃度不高，
因此如果說跑膠切膠再純化，
大概就回收不了太多DNA，
因此改變策略，
先將cDNA用較不理想的primer約略取到我們要的部分，
然後再用比較理想的primer進一步target...
之所以不直接用後者是因為直接用的結果無產物（有點奇怪）

好，現在二次PCR後跑膠，
同樣根據size..估計應為我們要的東西，
但是因為擔心進一步純化PCR會大量流失DNA，
因此PCR產物未進行純化，
而直接轉到vector(使用TOPO vector: pcDNA3.1D/V5-His-TOPO)
然後transform...利用Amp篩選～

得到的菌落進行mini-prep...
然後測sequence...
但是卻很扯，
因為～六個sample...
得到的sequence類似～
我可以順利找到我的primer sequence...
但是卻找不到我要的target sequence...
因為完全不知道我拿到的sequence是啥，
所以上NCBI blast...
結果出來的結果居然是vector...@@

如果說transform進去的是空的vector也就算了～
那我之前PCR出來弱弱的band跑到哪裡去了...-_-"
問了兩個實驗室，他們都說很詭異～

想請問大家知不知道為什麼會這樣～
到底我哪一步出錯了....> <



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◆ From: 12.206.233.228
推 ROKEE:我會建議用PFU+比較好的primer 多做幾次
→ ROKEE:把總量先提高,然後PCR產物先濃縮再去跑膠回收...
推 chiehgriffin:PCR cycle可以多一些，並且使用pfu，基因多大呢？
推 blence:pfu product拿去接TOPO，這樣要看到空的vector很容易
推 ROKEE:不建議PCR cycle拉高,容易出錯,我要接clone都只跑20個cycle
推 circleming:901 bp.這會影響嗎？