作者hurp (修身齊家治國賺大錢)
看板Biotech
標題Re: [問題] cloning
時間Wed Nov 1 16:17:38 2006
小弟的cloning 算是比較土法鍊鋼的, 提出來跟大家討論一下.
我基本上是做PCR subcloning, insert大小從1kb~3kb不等.
通常是用pfu, 30 cycle. 前題是PCR確定能work, 並盡量減少
template的量.一個sample跑兩管PCR, 這樣子PCR product比較多.
把兩管PCR product收集在一起,
加入1/10體積的3M Na-Acetate,
再加入10倍體積的純乙醇, 置於室溫15分鐘
室溫離心, 14000rpm, 15分鐘, 結束後應該可以看到有白色沉澱
倒掉上清液, 用70%酒精清洗沉澱物, 再離心, 去掉酒精
白色沉澱完全乾燥後, 用30 micro-liter的水回溶.
把回溶的PCR產物全部拿去做enzyme digestion (我的primer有設計RE site), overnight
第二天把sample進行gel extraction, PCR product的量應該是很夠"消耗"的了.
土法鍊鋼, 見笑了, 不過我用得還挺順手的,而且很適合經費短缺的Lab...唉...
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◆ From: 69.115.156.190
推 melodyrabbit:我覺得有時候手動的純度濃度反而比kit好喔! 11/01 16:58
推 Locutus:為什麼PCR產物還要enzyme digestion啊? 11/01 18:21
推 ssuny:因為不是做TA cloning..接一般的vector當然要用RE處理 11/01 20:06
推 mandible:不太懂??pfu可以做clone嗎? 11/01 23:46
推 Locutus:還是不懂,primer設計RE site是在兩條primer上再加RE site 11/02 17:10
→ Locutus:這樣PCR product出來不是就可以直接接進cloning site了嗎? 11/02 17:11
→ Locutus:不好意思,我沒做過cloning,所以有這種問題 11/02 17:12