推 ZecAhau:已經有加 8% DMSO了 DNAP 也換過多種 現在這種很"高級"囉 11/12 23:02
→ ZecAhau:還是很謝謝你 :) 11/12 23:06
→ apa9394:pfU嗎XDDD 11/13 15:13
※ 引述《ZecAhau (World Peace)》之銘言：
: 各位好
: 我現在是用 人類細胞株中抽取的 genomic DNA 當作 template 進行 PCR
: 想要 P 出一段長度約 3 K 的 promoter region
: 之前可能因為 primer 沒有設計好 一直 P 不出來
: 重新設計 primer 後 是可以在正確位置看得到 band
: 可是 不管怎麼改變 annearing 的溫度 DNA template 的量..
: 甚至是增加 cycle 數 (35 --> 40)
: 都沒有辦法讓這 band 的 signal 強一點
: 量一直都非常少....
: 我的 PCR condition 如下:
: 98 ℃, 3 min
: 98 ℃ 1 min
: 61.0 or 58.0 ℃ 40 sec
: 72 ℃ 3 min ×35 or 40
: 72 ℃ 10 min 4 ℃ ∞
: DNA template 的量 則是從 3 ng --> 2 ug 都試過了
: 不是 P 不出 就是只有微弱的 band
: Primer 則 FW RV 各加 100ng
: 要提到的是 因為是 promoter region
: 兩個 primer 都有 GC-rich 的情況
: FW 還好 ( 55 %)
: 但 RV 的 GC 高達 66.67 %
: 不知道這是否影響了我 PCR 的產率?
: 還是 DNA template 不夠乾淨??
: 或說這樣的 PCR 還有什麼需要特別留意的地方??
: 謝謝各位的指教~~謝謝!!
試試DMSO或Betaine吧.......還有taq用好一點的.....祝你好運
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