[問題] TA cloning

[Katoh (人工智慧)]

版上的高手大家好 有問題想請教大家

我的insert是primer有設計RE的PCR product(2.8k)

質體是pGEX-2TK(4.9k)

這陣子做cloning試了好幾次

(兩種RE insert跟plasmid分別各切4hr後

用gel extraction分別純化後在ligation 16hr)

最後挑出來的菌去抽質體都是原始質體

因此想改用TA cloning先接上去之後再切

但是我primer上面的RE在PCR cloning vector也有

(分別是SmaI&EcoRI)

跟vector上的切口還蠻接近的 不知道這樣會不會有影響

還有一點請教大家

就是pGEX-2TK上面SmaI&EcoRI是鄰近的兩個切口

GGATCCCCGGGAATTCATCG    (黃色是SmaI 紅色是EcoRI)
CCTAGGGGCCCTTAAGTAGC    (綠色的base兩個RE都有用到)

(不知道畫這樣看不看的懂)

是否可能因為太靠近導致vector其實只切了一邊的刀口

所以後續ligation失敗

謝謝大家

順便請問大家哪家的TA cloning比較好用呢?

問題有點多 真不好意思 再次感謝!

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◆ From: 140.123.127.44
※ 編輯: Katoh           來自: 140.123.127.44       (11/15 23:53)
推 aggaci:兩個切位太近要分兩次切，smaI本來就不好切了兩個切位太近
→ aggaci:又更難切了，話說回來smaI和EcoRI作用溫度不是不同嗎?
→ aggaci:你怎麼一起切的哩
推 Katoh:我是分兩次切的沒錯 兩種RE各切4hr 沒說清楚真是不好意思
推 aggaci:cleavaged plasmid有加CIP處理過嗎
→ aggaci:我是很想建議你不要用smaI啦......orz..
推 Katoh:因為2TK的MCS只有BamHI&EcoRI&SmaI 然後insert中間有BamHI囧
推 U0:乾洗這個原因？ http://myurl.com.tw/no7i
推 Katoh:我是先SmaI失活後再EcoRI 所以切質體應該不會有樓上的問題
→ Katoh:insert的primer的話SmaI切口外我有多三個base EcoRI多兩個
推 Katoh:primer多了base還可能切不乾淨所以我才想改試TA cloning :(
→ Katoh:我cleavaged plasmid沒有加CIP orz所以我應該先用原本的方法
→ Katoh:做insert然後質體加CIP先試試看嗎?
推 ROKEE:SmaI很好用阿..  @_@
推 aggaci:是地~