想請教各位大大關於cloning的問題
我的insert是primer有設計RE的PCR product(1.2K)
(用的是zero Blunt TOPO PCR cloning kit)
vector 是5K
用2種RE分別切(SalI/PstI)insert 和 vector(O/N),
切完之後跑膠,進行gel extraction
以elution buffer回溶
接著進行ligation(> O/N 16度)
Insert : Vector 莫耳數比試過 3:1 和 5:1
DNA total 濃度試過 56 和 222 ng
(用的是Takara T4 DNA ligase,也換過其他家廠牌)
最後進行transformation
(用的是HIT compentent cell,也用過益生的 compentent cell)
我所選用的抗生素是chloramphenicol(試過20和30 μg/ml)
最後一顆菌也沒長 > <
我在想會不會是因為vector上2個切點太近的關係(就在隔壁)
所以事實上只切了一刀
不過因為這個vector是從別的實驗室取得的 而他們切都成功
似乎駁回我這個想法
不知道板上的大大有沒有什麼建議提供給我
已經過了2個月了 都一直沒有成功 > <
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