※ 引述《lakerjackt (NN )》之銘言：
: 有人用過從血液中抽出的cDNA做real-time PCR嗎?
: 因為本身是用ABI的機器run real-time PCR...
: 但一直try不好PCR的condition...
: 不然就是有出來後...再做一次就沒出來了...
: 且Ct值一值都滿後面的...40上下...
: 所以一直做到沒信心...><
: 所以我想請問各位real-time PCR幾個問題..以解笨小弟我的疑惑..
: 1.real-time PCR做的時候,反應的量一定要加的很精準嗎???
: 2.ABI的real-time PCR是不是都不用設定annealing..這樣一定都做的出來喔??
: 3.因為我是用kit抽RNA,但是是用一般方法轉cDNA..所以會有可能cDNA轉的不好嗎?
: 4.請問有人用invitrogen這家的kit抽RNA嗎?...做後續效果都可做很漂亮嗎??
: 5.請高手幫我想一下我該怎麼辦...謝謝...
一些經驗 隨意聽聽囉
1. 當然越精準越好, 不知你做的是絕對 or 相對定量?
不過基本上看你反應出來的3重覆的sd值就可知道你反應準不準的
不然就是看標準曲線的斜率吧
2. 因為annealing 調件是已經內定了啦
我是不會去動它啦 基本上要動這個先等你其他很多東西都try光了
再來想動這個比較好吧
或是等到你做的很熟練了 要動再動囉
3. 當然有可能啊 不過一般方法也不外乎是用RT轉啊 多練練吧 熟練就沒問題啦
4. 有啊 我覺得沒有太大差異啦 Trizol就很好用了
不外乎抽完用 DNase 處理 , RT轉完用 RNase H 處理
PCR先夾夾看是否還有DNA汙染 再夾夾看actin是否RT有成功啊
跑膠看RNA品質 測OD看RNA品質
5. 要是我的話 我會回到根本的問題
a. 抽RNA, 抽完用DNase I 處理, 並回收.
b. 確認我抽的RNA品質沒問題 ( 確認 18s 28s RNA的狀況, 並測OD )
c. 先用RNA 做 PCR 測試是否還有DNA的殘留
d. 轉RT, 轉完後以 RNase H 處理 ,
回收後做PCR夾 actin or 其它 internal control
確認轉RT有成功
e. 確認完Step c 後儘快上機做Q-PCR
f. 確認Q-PCR的結果
要精準啊～除了三重覆外～SD值跟標準曲線超重要啊
還有就是NTC 有污染的話此次結果就不能用
e. 每一步驟都要確實確認後再往下做 不然只是無限循環罷了
那一個步驟發現有問題就請別往下做了 不然老闆會生氣浪費錢跟珍貴的sample
最後還有一些東東可以說一下
就是有心的話啊～ ABI本身的網站上就有教我們該怎麼樣玩Q-PCR啦
100頁不到啦 都看完的話 就也差不多就是那樣而以
那裡面的東西 應該比不論誰告訴你的都還要詳盡喔～
嗯 祝你實驗順利囉～～
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