Re: [求救] 抽pasmid的量都好少

[bluejelly (夢裡不知身是客)]

我最近也在用Promega Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System
也是問題連連

我慣常養2ml culture (in falcon 14ml tube), 16hr, 150-200 rpm
transfer 1.5ml到小離心管 離下來後照protocol做
以往這樣用QIAGEN的kit
或是自己配的buffer + 傳統SDS-alkaline lysis miniprep protocol
都可以得到很好的產量 大約5-10ug
(我用的質體都是high-copy number的 在DH5alpha中)

換到這個實驗室後用Promega
同樣的步驟 只能得到大概1-1.5ug的plasmid 根本沒辦法做cloning
菌長得很好 沒問題
又怕是overgrowth 我也試過將培養時間縮為14小時 產量還是很低
像是最後一步離心離久一點確保酒精都離掉了
或是加水時要放個兩分鐘再離
這些我都試過 沒用

後來labmate建議養5ml culture
同時正好舊的一組kit用完 開新的
結果怎麼做都有genomic DNA汙染 跑膠全是genomic DNA
除了resuspension那步用vortex
之後每步驟我都是mix by inversion 4~5 times
不知道genomic DNA哪來的
到底是我錯 還是這批kit有問題 ><

總之這組kit真的很難用
不推薦
再試不出來我就要自己配buffer用回傳統方法了

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◆ From: 24.162.236.21
※ 編輯: bluejelly       來自: 24.162.236.21        (12/18 12:20)
推 HerrHans:離完酒精後 或許可以放入烘箱 或自然風乾3分鐘左右
→ HerrHans:有些kit不能光靠離心把酒精 dry乾 還要烘一下或風乾一下
→ HerrHans:不過原廠protocol沒寫這步驟的話 我是覺得或許不需要
→ HerrHans:那就真的有可能是kit的問題 跟廠商追究吧...
→ HerrHans:可以跟別的lab 借別套kit一起做 這樣才有對照組^^
推 bluejelly:protocol上說column若過度乾燥可能也會低產量
→ bluejelly:所以我不敢烘或水浴加熱
→ bluejelly:我後來也有離完心放個兩分鐘再加水 加完水再放兩分鐘
→ bluejelly:也沒用Orz 我會試試去借別的kit的 謝謝建議
推 HerrHans:還有 我最後elute用的水或buffer都會以60~65度C 預熱
→ HerrHans:也可以幫助DNA的回溶....