[求救] cloning求救...一直做到怪東西阿

[ssuny (Cheer up!!!)]

從事現在在clone的蛋白已經快2個月了...

一直沒有好的結果...本人做到都快沒信心了

請各位版友好心幫個忙吧...幫我看看到底是哪裡的問題...

以下是實驗步驟及結果

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1. 將pET32a以RE切開 並將目標基因從pCRII上切下
   使用的RE為 Sal I 以及 Hind III

   電泳圖:http://www.wretch.cc/album/show.php?i=suny&b=8&f=1868850536&p=0
   最左邊為marker, lane 1是切過的pET32a(5.9k), lane 2是切過的目標基因(~0.6k)

2. 切膠回收

   電泳圖:http://www.wretch.cc/album/show.php?i=suny&b=8&f=1868850537&p=1
   依序為marker,pET32a,targer gene

3. Ligation , 比例約為1:5

4. 抽plasmid以RE處理確認
   分別以 Sal I 及 Hind III 處理, 可是跑完電泳後卻是怪東西

   電泳圖:http://www.wretch.cc/album/show.php?i=suny&b=8&f=1868850538&p=2

   如圖,4個sample切下來完全看不出來是pET32a,大小片段完全不對

   看起來也不像是污染...Orz...

   拜託大家給個建議吧...在這樣下去小弟真的要換題目了   囧


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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.120.208.29
推 ROKEE:妳的電泳圖沒標marker，怎麼看=  =
推 ssuny:唔..那我改一下好了...囧rz
※ 編輯: ssuny           來自: 211.72.204.94        (12/27 23:54)
推 cyken:ligation的vector 放多少 (ng) ?  大概長多少colony ?
→ cyken:有沒有 control組？ 不是埋頭苦幹兩個月就一定會成功，
→ cyken:試著在每個步驟盡可能做positive and negative control
→ cyken:這樣才能找出問題所在。
推 johnny853884:推樓上說的~~最近深深體會
推 turtle24:原po要記得load個沒切過的原vector & 切過的空vector