Re: [求救] cloning求救...一直做到怪東西阿

[werthers6925 (...)]

※ 引述《ssuny (Cheer up!!!)》之銘言：
: 從事現在在clone的蛋白已經快2個月了...
: 一直沒有好的結果...本人做到都快沒信心了
: 請各位版友好心幫個忙吧...幫我看看到底是哪裡的問題...
: 以下是實驗步驟及結果

  我特別去查了一下pET32a plasmid map.....
  我發現到一件事.....你可能要換restriction enzyme才能做出來.....
  原因如下.....
  在pET32a map上...Hind III的位置在第173bp而Sal I的位置在第179bp
  map上的序列如下:
                         Sal I
                        ------
      ------------AAGCTTGTCGAC----------
                  ------
                 Hind III

  你說你pET32a是用Hind III + Sal I cut

  在此幫你建立一個觀念.....鄰近的兩個enzyme最好不要一起用
  因為當你其中一個enzyme作用時會導致另外一個enzyme無法作用
  舉例來說: 假設Hind III先作用  作用完後linear plasmid會變成以下情形
                                      Sal I
                                     ------
                  -----A        AGCTTGTCGAC--------
                  -----TTCA         ACAGCTG--------

  之後,當Sal I準備要作用時, 請你注意一下
  在Sal I cut site的左邊(5'端)只剩下一個base pair
  這種情形大多會影響下一個enzyme的作用力....嚴重的話會讓他無法作用....
  所以,  你說你pET32a是用Hind III + Sal I cut......
  實際上, 卻只是pET32a用Hind III or Sal I cut......
  你的clone一定會做不出來............
  你試著換另一種enzyme....兩個enzyme距離遠一點(至少要離3~6 base pair以上)

  不同的enzyme所需要的距離也不同, 如何查到這種資訊?
  你可以去翻NEB給的catalog......
  在最後的附錄地方..給了很多restriction enzyme的information....
  包括在primer上加restriction enzyme旁邊需要留多少base pair作用效果才會好...
  oligo-DNA上(例如linear plasmid)旁邊要留多少base pair作用效果才會好...
  等等......
  這些資訊都可以查的到.......
  ENB catalog是一本不錯的工具書(對常做sub-cloning的人而言)....

  對於你的問題....我相信你只要將其中一個enzyme換掉...應該就可以解決....
  希望你順利....

  Best.....



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推 boyo:版主這篇要m啦
推 linzhengzhan:漂亮的解答……大推…
推 ZecAhau:真是強者~!
推 rebirth:我以前也幹過這種事 選了兩個太近的RE site
推 HIbaby:推
推 cyken:距離一個bp的話,Hind3效率是零!  Sal1還有61%效率
推 mobisrat:http://0rz.tw/581iF
推 microball:用pET vector 的人還真多呀 (茶)
推 JeffreyS:推!!