[問題] 請問抽取yeast plasmid

[Shamino (萬年豬)]

     最近在做抽yeast plasmid,再transformation 至 E.coli

     不過抽取yeast plasmid 總是抽的很不穩定,

     transform 至E.coli的 plate colony幾乎不會長或是極少( n < 5 )

     因為市售的kit很貴

     試了molecular cloning中的方法覺得很難用之後

     從網路上找到了兩種prtotocol

     http://www1.qiagen.com/literature/protocols/pdf/PR04.pdf

     跟

     http://www.med.unc.edu/~hdohlman/plasmidisolation.html

     這兩種都是用 mini-prep 的方法 再加入 beads 來抽取yeast的 plasmid

     不過這兩種方法還是很不穩定, 失敗率還是很高

     目前是已經先行排除後續trasformation的問題(非 competent cell, plate 等)

     也並非yeast cell來源的問題( 同一株yeast 接出來抽,時好時壞)

     而小弟的方法流程就跟上面的protocol一模一樣,兩種都試過,都時好時壞

     想請問有先進是用類似方法做的很穩定又好的嗎?

     希望有任何可以指點小弟的地方

     感謝再先呀


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◆ From: 220.139.222.8
推 kirry:抽yeast plasmid,再transformation 至 E.coli ??這是?
推 freesoul:是yeast 2 hybrid後續要拿candidate出來嗎?
推 cplinn:有什麼奇怪 amplification 用啊
→ freesoul:假如是這樣的話我的經驗是PCR送sequence後問有沒有人有
→ freesoul:還比較快...XD
推 angelhunter:我的經驗是要用電菌的 效率差很多 可能是plasmid太髒
推 ROKEE:我猜原po可能為了要定序吧
→ ROKEE:如果真的如我假設,那乾脆加熱破yeast後直接拿crude extract
→ ROKEE:做heat shock送E. coli就好，還是會長......
→ ad1980:我前輩試過，據他的經驗用heat shock transform 出來真的很
→ ad1980:很少，建議用electroporation，efficiency好很多，真的。
→ ad1980:我做Y2H的時候也是要抽，但我是用electroporation，
→ ad1980:完全沒有這個問題...所以可以試試看。
推 tin0101:去買genemarl plasmid kit 很便宜.
推 ROKEE:crude extract沒辦法用電的,一定會爆給你看XDD  太髒了...
→ ROKEE:我連ligation product都會爆炸  @_@  非得先純化才行
→ ROKEE:而且heat shock送E. coli效率綽綽有餘,又比用電的方便很多
推 Shamino:感謝各位提供不少意見:)這幾天小弟會再試試:)