Re: [求救] cloning~~~cloning~~

[baca (大笨蛋大笨蛋~~~~~)]

※ 引述《werthers6925 (...)》之銘言：
: ※ 引述《baca (大笨蛋大笨蛋~~~~~)》之銘言：
: : 想請問大家CLONING~~~拜託拜託~~~
: : 做好幾個月了~~還是弄不出來~~
: : 我的insert約1.8kb~~在PRIMER上設計BamHI  與  SmaI切位
: : 後來實在沒辦法就先接在TA-VECTOR上(牌子是RBC)
: : 我使用的VECTOR有6.8kb
: : 後來做SUBCLONE還是接不進去~~
: : GEL EXTRACTION的KIT是用慧眾的~~
: : 看圖是都有切但是就是接不進去
: : 有可能是酵素亂切嗎?!BUF壞掉嗎~~???!!!!
: : 嗚嗚~~~求救~~~
: : _
:   由於你給的資訊很少, 因此就你所給我們的資訊,
:   我們也很難正確的幫你判斷你真正的問題出在哪裡.....
:   頂多只能告訴你該做什麼control, 該留意什麼事情....
:   如果可以的話, 不知你是否願意寫的詳細一點....
:   包括 TA-vector是用哪一家牌子?叫是什麼名稱?
:           vector是用哪一家牌子?叫是什麼名稱?
:   (這樣方便我上網找出map, 進而判斷在vector上的cut site是否選取恰當,有問題)
:   最好是能把實驗流程寫一下.....
:   RE怎樣作用?在什麼溫度?用什麼buffer?

謝謝各位~~^____________________^我找出原因了~~
居然是我家的BAMHI BUF壞掉~~~
所以一直切不好~~~接不進去

:   怎樣純化DNA?用什麼方法?什麼KIT?
:   您寫的越詳細, 我們才能精確的幫您判斷可能發生問題的因素.....
:   言歸正傳......根據你所給的資訊....而加以推論.....
:   你的insert最出是用PCR的方式做出...並且primer上加上BamHI and SamI....
:   -->做不出來!! (可能是由於primer上5'端沒有額外加base所造成)
:   之後, 你將insert接在TA-vector上....
:   並且先用SmaI再用BamHI切.....
:   -->仍然做不出來!!
:   (因為insert已經接在TA-vector上..就和primer上5'端有無額外加base已經無關...
:    推翻先前假設.....)
:   先用SmaI切, 假設你是用NEB的RE....
:   SmaI是用NEB buffer4.....
:   就算你沒有換buffer直接加入BamHI作用....
:   BamHI在buffer4的作用活性也有75%.....
:   因此RE在insert上的作用應該很好........
:   接著看vector的作用能力.....
:   你說你的transformant colonies長的很多, 但很可惜沒有做vector的control....
:   由於你的colony長很多...但卻沒有一各是你要的clone....
:   因此就可以直接看成是vector的control....
:   (雖然不知道挑出來的是vector only還是雜菌.....)
:   也就是說.....你的vector作用不好......
:   你的問題....應該是出在RE作用在vector這各地方.....
:   至於原因為何?
:   由於您給的資料很少....所以無法判斷.....
:   以上小弟推論.....不知有無幫上忙....

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 140.112.60.28
推 Bluecold:這理由...好....囧
推 a64toto:請問是如何知道buffer壞掉的?
推 Crow22312:跟隔壁家借?
推 baca: 其實我是一樣一樣換新的~~原本也想說不可能是BUF有問題~~
→ baca:後來隔壁實驗室的學長幫我是一個東西都用他家的除了BAMHI buf
→ baca:不過也是剛好那時他找不到他家的BAMHI BUF所以只有BUF是긠
→ baca:我家的~~~結果也是TRANSFORMANTS很多~~但挑不到~~
→ baca:於是我把BAMHI BUF換新的~~~結果十個有八個是~~
→ baca:所以才知道是BUF的問題~~~我想是BUF有問題造成STAR ACTIVITY
推 ebiyaya:這也太神奇了吧~~總之恭喜做出來了 ^^
推 sssos:可是你之前不是說切一刀都沒問題? 哈，總之恭喜。