[問題] NotI digestion的問題

[wanyi (我討厭吃便當!!!!)]

      最近在做cloning
      好不容易把100bp的insert弄進plasmid之後
      現在又遇上了NotI不切的問題
      我要做的是一個double digestion (BsrGI/NotI)
      因為兩者buffer不一樣~所以先切BsrGI
      Qiagen kit purify之後再切NotI
      之前有試過似乎要overnight才會切的比較好
      但效果還是很差
      我查過NEB的catalog說NotI是methylase sensitive
      但是實驗室沒有Dam-/Dcm-的strain
      想問大家有沒有人在這樣的情況下有比較好的方法
      還是digestion overnight是唯一的方法呢?
      對了，我現在用的是DH5 alpha competent cell

      謝謝!!拜託高手幫忙~

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    夜已晚的很美麗      天已亮的很分明

        我在你的回憶裡       是黃昏還是黎明

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◆ From: 140.180.7.220
→ wanyi:對了補充一下 RE也是NEB的
推 blence:NotI是CpG island sensitive,你上面的想法不是切不好的理由
推 wanyi:謝謝你~我應該是誤會了! 那請問有什麼方法可以解決嗎?
推 zytase:NotI,含切位:24個base->90% cleavage @ 37度 20小時
→ zytase:             20個base以下->0~10% @ (同上條件)
→ zytase:以上是針對 DNA fragments,基本上它是需要over night~
推 wanyi:謝謝你!!!那我還是努力的延長反應時間吧!
推 oooya:請問有幾個切點???切太久也不太好 主要還是要看你的用途為何
推 wanyi:我的plasmid上只有一個NotI site,試過三個小時切不好
推 oooya:請問已經做好的clone 要再把他切開來的目的為何?
推 wanyi:要把一段gene用另一個PCR產物取代~
→ wanyi:所以我vector跟PCR product都要用NotI切
推 shaline:會不會沒加BSA啊?!