Re: [問題]蛋白質表現的問題

[satantaco (TACO)]

※ 引述《satantaco (TACO)》之銘言：
我的insert約2.2kb
然後使用pET-30 EK/LIC vector
它是使用一段LIC序列 在insert兩端
然後經過PCR後就可將產物放進vector中
接著我轉型至novablue中挑選
也挑到了符合大小的plasmid
然後抽取後再轉型至BL21(DE3)pLysS表達菌株中進行表達

表達的條件基本上是以37度 250rpm 養至O.D600=0.6然後加入終濃度1mM IPTG
再繼續以37度 250rpm 培養三小時
但是抽出來的粗萃蛋白經過跑SDS-page後
在預估的大小片段位置卻沒有與未表現的控制組有差異

更改過表達溫度
即加入IPTG後以30度或25度  20度等條件作誘導
但是粗萃蛋白依樣沒看到再預估的大小有差異

此外以his-tag column然後上AKTA Prime跑純化
也沒純化出東西
而且elution洗下的fraction跑SDS-PAGE會有好幾個片段
但沒有主要的片段 而且也沒有我預估要的大小

請問我要如何改進我的實驗
麻煩大大們提供意見

目前我所想到的有在誘導時加入0.5~1%的葡萄糖
以及加入PMSF
目前正在進行

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◆ From: 140.121.156.30
推 ermine:換個vector或換隻菌吧  感覺上根本沒表現出你要的蛋白質
如果還是沒表現出來可能會嘗試換隻菌  目前進度可能這週末吧
推 bee:妳的狀況很清楚.....蛋白應該是沒有表現出來
→ bee:either 回頭去檢查 cloning 有沒有問題 or  妳要換表達系統
→ bee:加 glucose 的方法要從一開始 transform 然後利用短生長去挑菌
→ bee:如果妳確認 cloning 是對的才需要試這個
我有在誘導後的菌液離心取菌作colony PCR 質體又是對的
然後加glucose是protocol裡有建議如果表現的基因對菌是有毒的話
可以加glucose穩定質體丟失的情形  增加表達
所以嘗試看看  至於你說的利用短生長確認cloning的方法
在protocol裡是說對於T7lac啟動子及帶有pLysS的質體並不可靠
推 longy:去把你的質體抽出來 送定序吧~~先check這裡~~
定序的部份  在轉型的選殖菌株Novablue時
已經定過序了  也再三確認過密碼子
應該是沒問題的

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◆ From: 140.121.156.30
推 Jayc:換HOST阿~~ 要不然就換plasmid...pQE不知如何?