※ 引述《kayle (kay)》之銘言：
: 關於mammalian cell total protein extraction的問題
: 因為lab設備問題,無法用物理方式破細胞
: 我在網路上找了幾個buffer
: 目前用的是類似RIPA的配方
: 含Tris, NaCl,EDTA, 0.2% Triton, 0.1% SDS, 1mM PMSF
: 10的6次方細胞加入50ul
: 再把細胞lysis後,12000rpm,離心 30 min之後
: 有個取上清液的步驟
: 我可以很清楚的看到細胞被lysis, solution成透明
: 可是整個solution呈現很黏稠的的情況(DNA造成的嗎?)
: 幾乎沒辦法取"上清"
這個配方的lyse算是很暴力的
破膜破核，許多membrane-associated protein都會release出來
我有做過類似的實驗，為了extract頑強的membrane-associated protein
黏稠後100度去煮個十分鐘(小心不要讓水蒸乾)
溶液會不黏稠
之後dilute total solution volumn讓solution中SDS濃度降低
這樣之後sample可以IP，或做其他的用途
我這樣做是OK
但是一般用buffer破細胞應該不需要加SDS吧
我自己的實驗經驗一般用NaCl配上Tx-100和其他八拉八拉的inhibitor
就很好用了
: 除了增加reagent用量外
: 該怎麼處理這個情況??
: 請有經驗的大大幫忙一下,感謝!!
: 另外一個笨問題
: SDS是很強的介面活性劑吧
: 那他到底會不會把protein denature掉??
會喔，整個把native protein翻出來
: 那如果後續要做蛋白質純化 (protein要有function)
: 是不是就不應該用SDS??
的確不能
: 那又該用什麼reagent來lysis細胞呢???
就用一般的吧
我的lyse buffer(whole cell extract buffer)是
NaCl 150mM or 200mM
Tx-100 0.2%
Tris-HCl(pH 7.5) 20mM
EDTA&EGTA 1mM
和protease inhibitor，DTT，若是要研究phosphorylation還
要加phosphatase inhibitor
: 感謝!!!
希望對你有幫助
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