※ 引述《josher.bbs@ptt3.cc (Vet)》之銘言：
: 小妹很久沒有做了
: 最近開始做 要做的是cKit (RTK), AKT and ERK
: 我使用的lysis buffer 之前都沒有問題
: 最近不知道怎麼好像出了問題
: 我在二月初有做一個sample as positive control 我收細胞wash
: 之後用lysis buffer 4C shake 1 hr (濃度7 ug/ul)
: 那個sample所有的東西都做的出來
: 可是過了一個禮拜
: 我做同一個實驗 不過開始做treatment
: 不過因為想要放100ug total protein per lane
: 所以我放非常少的lysis buffer 而且改成冰上15 分鐘 4C離心十五分鐘
: 蛋白濃度在14 ug/ul左右
: 我用2x sample buffer loading dye跑gel
: 可是很怪的是 我load一樣的量
: 我第一次做的control(我拿來當western control)
: 似乎比我之後實驗組中的control(無treat)的高很多
: 也就是整個phospho-protein 強度 再我某個時期之後做的蛋白都偏低
所以是說phosphorylation level在你兩次實驗protein濃度一樣的情形下變低囉?
會不會有可能是你的Ab的問題
可能隔一陣子了認的比較不好
也許整個western你兩次做的condition不太一樣
有點不太懂你的問題
要不要再PO詳細一點^^
: 但是我的total protein是相同的
: 請問是因為我clear不乾淨嗎?? 我收的時候有覺得有白白的東西在上液體
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是說lyse完離心後sup還有白白的東西嘛?
如果是有可能沒有離乾淨(有可能)
這樣有可能影響到測protein濃度的正確
: 所以很多debrid都被我一起收下來了??
: 導致蛋白濃度根本是錯的??
: 還是我蛋白濃度太高了?? 所以黏在一起 可是我有用95C 10 min
: or 我的phosphase inhibitor失效了??
: 埃 我真的不知道問題在哪裡
: 請各方高手替小妹指點迷津阿.....
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