[求救] colony PCR有P到 但定序無結果

[pan7353 (要變成自己喜歡的模樣)]

不好意思 這個問題我其實已經問過一次了 但是還是沒有解決

我的 insert DNA 有 846bp(PCR 得到的)

放到 yT&A 的 TA cloning vector 中(用 TA clone 接)

藍白篩選了六個 colony 做 PCR 結果都有 specific 的片段(用insert DNA的primer P)

挑了四個 colony 送定序後 結果四個都沒有 insert  DNA 的序列

(用 vector 上的 M13 定序)

甚至連當初做 colony PCR 的 primer 序列都沒有

我已經試過的方法

1.換 pGEMT system 其他一樣 無效(因為我懷疑 colony PCR P 到 vector 上其他序列)

2.定序結果我有試過互補和反轉的序列了 都一樣 定序結果只有 vector 序列

3.直接抽 plasmid 用RE切 結果顯示沒有插入任何片段

4.把當初 PCR 得到的 insert 片段直接送定序 結果是正確的序列

5.另外 我們實驗室有三個人做 cloning 都發生一樣的情況 就是 colony PCR 有 band
  但定序回來都只剩下 vector 序列

抱歉 問題有點長 其實我的重點就是 為何colony PCR 可 P 到 定序卻無結果?
那麼 colony PCR 究竟 P 到了什麼東西勒?

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 140.112.79.56
推 aminoacid72:會不會是P到原來的insert,但該insert沒有接在vector上
推 ssuny:colony PCR 會有false positive的情況..抽plasmid切比較保險
推 rivis:應該用M13 primer做colony PCR，用原來的primer會P到
→ rivis:一些殘餘的insert DNA，而且最好抽plasmid切切看insert