[問題] western blotting!! 常抽到DNA!!造成拖帶...

[killmebaby (不錯喔)]

最近做western blotting時,不知到是cell lysate處理的不好,還是怎樣,都會抽到DNA,
造成在跑SDS-PAGE時,都會看到明顯的拖帶現象..
試過離心多次一點,或是lysis buffer加多一點,但好像都沒有改善,還是會隨機的
抽到DNA.

可以請大家告訴我幾個方法嗎?快被這一點搞昏了....
謝謝大家!!

我的protocol:
1.using cold DPBS to collect cell
2.RIPA lysis buffer(我怕說是不是太強,打破核膜,才會拿到大量的DNA,因為我們
  lab要看細胞膜上的蛋白質,所以lysis buffer要強一點)
3.加lysis buffer to cell pellet(我大約都加150ul/(3*10)6 cell
4. vortex 2 minor longer
5. sonication 5 min
6. 4度C 離心  13200 rpm  or   16100 rcf , 10 min
7. transfer supernatant(原液) to new microtube
8. protein定量 (原液在取時有vortex,怕取不準)
9. 再次將原液離心,4度C 離心  13200 rpm  or   16100 rcf , 10 min
10.搭配lysis buffer將原液稀釋到一定量(approximate 80 ug/well),這次原液離心
   第二次完,取出稀釋時,沒有vortex
11.加入sample buffer & DTT, 沸水中煮3 min
12.煮完後,直接loading
13.160V, 1hr (此時就看運氣了,有時很好,有時就會拖帶很明顯)

P.S 我想應該不是膠的問題,我是用現成的, Invitrogen  NuPage

..希望大家幫我看看錯再哪了..謝謝大家
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◆ From: 163.13.115.19
推 linker0726:能把你處理方法波出來給大家看看討論嗎
※ 編輯: killmebaby      來自: 163.13.115.19        (04/14 21:13)
推 runpapa0520:你假如懷疑是DNA的話 加DNAse DNA就光溜溜啦!
推 melodyrabbit:試過把protein煮久一點(>5min)再load嗎?
推 killmebaby:沒有ㄟ...想說應該不用煮太久..
推 pacity:你跑很快  是在冰箱跑的嗎?
推 killmebaby:RT跑的..
推 pacity:跑太快會產熱  跑出來會比較不sharp 可以跑慢一點
→ pacity:或是把buffer跟膠先放到冰箱預冷