※ 引述《killmebaby (不錯喔)》之銘言：
: 最近做western blotting時,不知到是cell lysate處理的不好,還是怎樣,都會抽到DNA,
: 造成在跑SDS-PAGE時,都會看到明顯的拖帶現象..
: 試過離心多次一點,或是lysis buffer加多一點,但好像都沒有改善,還是會隨機的
: 抽到DNA.
: 可以請大家告訴我幾個方法嗎?快被這一點搞昏了....
: 謝謝大家!!
: 我的protocol:
: 1.using cold DPBS to collect cell
: 2.RIPA lysis buffer(我怕說是不是太強,打破核膜,才會拿到大量的DNA,因為我們
: lab要看細胞膜上的蛋白質,所以lysis buffer要強一點)
: 3.加lysis buffer to cell pellet(我大約都加150ul/(3*10)6 cell
: 4. vortex 2 minor longer
: 5. sonication 5 min
: 6. 4度C 離心 13200 rpm or 16100 rcf , 10 min
: 7. transfer supernatant(原液) to new microtube
: 8. protein定量 (原液在取時有vortex,怕取不準)
: 9. 再次將原液離心,4度C 離心 13200 rpm or 16100 rcf , 10 min
: 10.搭配lysis buffer將原液稀釋到一定量(approximate 80 ug/well),這次原液離心
: 第二次完,取出稀釋時,沒有vortex
: 11.加入sample buffer & DTT, 沸水中煮3 min
: 12.煮完後,直接loading
: 13.160V, 1hr (此時就看運氣了,有時很好,有時就會拖帶很明顯)
: P.S 我想應該不是膠的問題,我是用現成的, Invitrogen NuPage
: ..希望大家幫我看看錯再哪了..謝謝大家
你這個方法是看total cell protein吧？而你說想看細胞膜的蛋白？
你應該去買專門抽膜蛋白的kit PIERCE有
也許會貴點，但是你連PAGE都用現成的，我想這KIT對妳們應該不會太貴！
另外，你說會拖？你是不是overloading了？
因為你都sonication了，DNA大都被你打成小片段了，應該不會造成問題！
還有sonication稍久了些
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