推 aggaci:你blocking用BSA還是牛奶？ 04/16 20:56
推 fodo:用NET buffer(含NaCl, Tris-HCl, EDTA, gelatin, Tween20) 04/16 21:48
請問使用western blot偵測phosphorylated protein kinase時
每次跑出來的結果很不穩定，有時候可以看到磷酸化現象，有時候又看不到
不知道是在那個步驟出了差錯？
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自己覺得可能發生問題的地方
[1] lysis buffer成份
我所用的RIPA buffer為(50mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 0.5mM EDTA,
1mM DTT, 1% NP-40, 0.5% Sodium Deoxycholate,0.1% SDS)
使用前外加 protease inhibitor和phosphotase inhibitor
這個配方是kinase activity assay kit裡面裡面建議的RIPA配方
但是又有看到有資料上寫說進行kinase assay時不可加入Sodium Deoxycholate
不知道是不是我加了什麼不該加的東西呢？
[2] SDS干擾
會不會因為SDS-PAGE裡面的SDS把所有蛋白都加上了負電，
如果要看的蛋白分子量太大，多了一個磷酸根跟沒有多磷酸根，將無法被分辨
我要看的蛋白是Src kinase(~60kDa)和ERK(~42kDa)
這兩種蛋白需要跑non-denature gel嗎？
查paper作磷酸化很多人也是用SDS-PGAE在跑
[3] 溫度影響
收完cell lysate後，每100ul加入2.5ul的β-mercaptoethenol，100℃煮10 min
每次要跑膠前再煮100℃ 2 min
這樣會boiling過頭嗎？ 莫非磷酸跟會煮一煮就掉下來嗎XD
我是實驗室第一個作磷酸化實驗的
作了好幾個月都一直這樣若有似無
不知道一般作磷酸化還有哪些地方是影響結果關鍵的步驟
想請各位有經驗的學長姐提供我可以改善的地方
謝謝各位^^
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