[問題] RT-PCR

[andyz (像笨蛋一樣)]

查了一下前文,沒有問到類似的問題,請教版上前輩

設計了一組primer, forward tm 57.4, reverse tm 56.6 長度都是 22 mer

PCR product為188 bp

用pcr 去夾genome DNA確定可以夾出一個很亮的band,大小也正確

可是當做RT-PCR想去夾該基因的時候 卻出現兩個band

一個為 188 bp比較弱, 一個為約260~270 bp 較亮

想了很久不知道有什麼原因會這樣

cycle 為 95度 30秒  54度 10秒  68度 15秒



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◆ From: 140.129.151.142
推 lakerjackt:你的primer設計不好,導致cDNA裡頭有別的序列夾出來
推 andyz:可是我有用primer 所夾出的sequence去 blast原來的genome
→ andyz:並沒有against 其他片段
推 lakerjackt:但你有沒有去check你的DNA->RNA時,有新的序列出現,懂嗎
→ lakerjackt:因為轉錄後要除去intron..就有可能有新的連續序列
推 andyz:謝謝前輩的回答喔！只是我現在做的是E.coli~
→ andyz:恩～ 我再想想看 轉cDNA時 是否有可能出現不一樣的序列
推 lakerjackt:建議你去做sequecing,因你的是原核cell,所以有可是..
→ lakerjackt:pcr產物自己黏在一起,再做pcr...才導致大片段