推 ldy:可能是reuse的beads. 05/01 11:25
推 likelego:有可能是reuse 的沒洗乾淨，有殘留。 05/02 17:10
推 ColdP:謝謝... 後來我用全新的bead重新pre-clear 果然大部分的 05/03 00:56
→ ColdP:的non-specific binding都消失了. 05/03 00:57
我之前在用New England biolabs的protein G磁珠作IP
剛開始的時候還滿順利的，
有些抗體真能抓到東西，
而且在negative control中(只有sample和bead)，
不會elute出任何東西......
但是不曉得為什麼，
最近我重複之前的實驗，
卻不知為何開始出現問題了 囧>
我的negative control中開始出現大量的non-specific binding，
出來的pattern居然還和我的實驗組有些類似，
這樣我不由地開始有些懷疑之前得到的結果了...
我仔細地翻閱了一遍自己之前的實驗記錄和data，
老實說我現在的IP作法和之前的IP作法基本上是一樣的，
但是我以前的negative control可說是相當乾淨，
現在的negative control卻相當髒...
真要說作法有什麼不同，
大概也只有我現在是用reuse的bead作preclear(不然太浪費了)，
還有我剛作的時候沒有加入PIs(pepstatin A, leupeptin, benzamidine, PMSF)
這些有可能是原因嗎?
補充比較細節的部分，我用的IP buffer類似RIPA buffer:
10 mM Na2HPO4, 200 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0.1% SDS, 0.5% NP-40, pH 6.3
wash次數為三次，都是用IP buffer進行wash, 基本上wash到第三次就已經
wash 不出什麼東西了....
elution buffer是0.05M diethylamine, 0.5% deoxycholate, pH 11.5.
老實說我都用了這麼強的IP buffer,
居然還會在negative control 看到non-specific binding實在讓我很吃驚 <囧>
由於整個實驗室就只有我在作這個東西，
老闆對於這樣的現象也不知道為何會如此，
希望有經驗的版友能夠分享一下可能的原因....
謝謝!
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