[問題] 有關ER上面的membrane protein

[ddNTP (冏)]

我目前手上有一個基因 [構築在pEF6/V5]
是在ER上面類似translocon的protein
建立stable clone後，卻沒辦法利用 V5 antibody辨識到

1.我確定它的確有in-frame

2.加bla篩了兩個多月了，挑了72個clone，一個都沒有   冏

後來想到，會不會是membrane protein的關係

我們是whole cell直接加入RIPA,4度作用30分
看paper，其他人是sonication後，高速離心分出membrane protein
[但這可能是purify用的]

總而言之，有沒有哪位可以跟我說一下可能出現的問題
另外，有沒有做ER方面的人可以討論一下

大感激!!!!!!!

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 140.120.213.177
推 b46006:transfection後兩天就可用WB確認了 有的話再挑clones
推 ddNTP:其實我有用transient確認過
→ ddNTP:第一次有被V5辨識到，才挑stable clone
→ ddNTP:後來挑了stable clone後，就沒辦法被V5給認到了  [哭]
→ ddNTP:後來在進行一次transient的實驗，那條band就離我而去了
推 b46006:CMV promoter容易被inactivated 不過問題好像是根本沒表現