Re: [求救] 請問ER stress的測量方式

[wuwawei (Wuwa)]

這是我之前問大家ER stress的問題
後來我使用測GRP78（bip)的方式
加我的刺激劑  測時間點
一開始我直接用lysis buffer下去收細胞
離心之後取cytosolic fraction
前兩次看起來好像有反應 但是後面又做了幾次都做不出來

之後我參考一些paper
大家好像都收whole cell lysate
我第一次用PBS把細胞刮下來 sonication之後直接跑
結果看不太到GRP78的表現
我們老師就叫我改用lysis buffer收 sonication之後直接跑
結果跑出來非常一致 看不出時間變化 =.=

我想請問我應該要怎麼收才對
因為細胞受到stess之後 GRP78應該是由ER的膜上跑出來才對吧？
我的想法是
先把細胞脹破 保持胞器的完整性 離心把細胞膜和胞器離下來 收集cytosol fraction
再用強一點的lysis buffer加下去 然後sonication把ER上的protein通通lysis出來
最後比較cytosal和最後膜上的GRP78表現
如果ER受到stress
cytosal的GRP78應該會增加 而ER膜上的量會減少


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※ 編輯: wuwawei         來自: 203.71.94.31         (05/23 19:05)
推 liuse:應該是可行   之前人有這樣做過媽paper上?
paper上都寫total cell lysate或whole cell lysate
但是我用幾種方式都收不太到 反應不明顯
我接下來應該會使用最後我想的那個方式收看看
謝謝^^

推 pshamrock:GRP78通常在total cell lysate就會上升 when ER stress
請問你的意思是說
lysis buffer收下來之後 sonication之後直接跑western看嗎？
還是需要經過離心？

ER stress之後GRP78是protein的表現量增加 還是 會translocation？
我念到的review感覺是translocation
請問我有誤解嗎？
謝謝^^

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※ 編輯: wuwawei         來自: 203.71.94.31         (05/24 15:14)
※ 編輯: wuwawei         來自: 203.71.94.31         (05/24 15:15)
※ 編輯: wuwawei         來自: 203.71.94.31         (05/24 15:15)
推 liuse:都會喔 所以染direct lysate應該也會增加
→ liuse:你直接收細胞後加sample buffer  然後sonicate就可以跑了
推 wuwawei:謝謝你喔^^ 我再試看看
推 kalfan1:是說不用加 lysis buffer 嗎?