推 paveway:stable clone的亮度不會像transient transfection那麼亮喔 05/30 10:52
請教諸位高手
我想要讓腫瘤細胞表現特定蛋白質
選用的系統是invitorgen的GFP Fusion TOPO vector
可以用geneticin做selection
transfection reagent選用Fugene
做完transfection後兩天 觀察到有部分細胞有明顯發亮
但是比例不高 而其他細胞是完全不會亮
以kit所附的GFP plasmid做的control 會亮的細胞比例也是差不多
於是換了含有geneticin的medium培養 預備將有transfect成功的細胞篩選出來
很多細胞就脫落死亡
換過兩三次medium後subculture
control組的(fugene only)的細胞是完全死光了
理論上來說剩下的細胞可以抵抗geneticin 應該是可以表現GFP
可是我去看螢光 本來期待可以看到繁星點點
可是卻發現很亮的細胞變少了
但是視野下充滿了微微發亮的細胞
科學一點的講法 很亮的細胞曝光1/4秒即可抓到影像
微亮的細胞曝光時間拉到一分鐘也不是很清楚 但是從目鏡可以肉眼觀測到
不知道諸位有經驗的達人 這樣算是有篩選成功嗎
還是要整盒細胞都會非常的亮呢
微亮的細胞是背景嗎
可是先前(fugene only, no plasmid)組的細胞是一點亮度也沒有的
感覺十分迷惑
我已經收下一部分的細胞預備以western測試我的表現蛋白
但是還是想先請教一下有經驗的達人
這種狀況是發生了什麼事呢
感激不盡!!
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