→ elderbear:但是要克服 duplex 的 primer 效率競爭之類的問題吧 07/11 23:54
→ elderbear:我還沒try出最適合的條件...有沒有經驗談呢??(自行設計ꨠ 07/11 23:55
→ elderbear:的primer&probe) 07/11 23:55
※ 引述《elderbear (曖昧不好不要曖昧)》之銘言：
: 想請教一下 重複之間有差異(假設三重複的曲線不完全重疊)
: 大家會把這樣的差異歸納在哪裡? (取樣問題? pipeting error?? PCR 效率???)
: 還有什麼其他我忽略的可能嗎? 還是就是機差??
通常是一定要全疊在一起
(我都做2平行的重複，reagent太貴了)
我都是把兩管(算2.1管)的量"均勻且不起泡"混在一起在分裝到兩個PCR tube裡
這樣做絕對超準！！
: ※ 引述《Highwind (小羊回來了)》之銘言：
: : 才做三重複喔
: : 六重複再來看吧,PCR的差異很大喔
: 我自己在做也是做三重複...
: specialist 是跟我說當兩條線很接近而有一條較偏離...可以考慮omit它 (經驗法則)
: 但是老師跟我說作三重複的的理由就是要用三重複去平均機差使得機差降低
: 所以...我目前也只能全部都不捨棄的去分析 = =
: : 簡單的定量就拿該gene稀釋10x,100x.1000x與Ct做檢量線
: : 條件抓的好通常還滿直的
: : 這樣就能比較出與control的倍數差異
: : housekeeping gene也做相同的事,務求precision提高
: : 如果同一批連housekeeping gene都差異很大就不用做了,從頭練技術
: : 題外話
: : 你看到結果沒差個5-6倍,最後還用統計硬凹的paper請懷疑他
: 我不太懂基因表現量的分析是怎麼分析的?
: 不過我是在作基因改造含量的分析
: 對兩個目標片段拉兩個檢量線
: 然後把同個樣品的兩個基因的量相除得到基因改造含量的比
: 可是不是算出來多少就是多少嗎?
: (舉例來講,放0.1%樣品可能做出0.08~0.12% 放0.5%樣品可能作出 0.46~0.56%)
: 不太懂什麼叫做"結果沒差個5-6倍"這樣的結果?
: 可是幫忙說明一下嗎??
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