Re: [問題] 使用Urea deaggregation後回收率?

[aggaci (下棋吧 five chess)]

※ 引述《ronall (暱稱小公主的!扣十分先)》之銘言：
: 抱歉
: 小弟又來請教各位了
: 小弟純化蛋白後
: 發現蛋白有aggregation的現象
: 我擔心這會影響我的蛋白產率
: 所以想使用Urea去deaggregation
: 之後想使用透析的方式除去Urea
: 我想問的是
: refolding回來且為正確結構的蛋白能有多少?
: 因為我有問過我家的博士後
: 他跟我說別將urea處理後的蛋白混在正常結構的蛋白中
: 他認為refolding的結構不確定正確與否
: 必須經由CD去鑑定
: 不知各位有什麼樣的想法呢?


  通常會加一些chemical chaperon去幫助folding
  如glycerol，我記得古早的PNAS有針對這一點發了一篇article

  refoldingㄧ定會有一些沉澱，沉澱可能是folding錯誤所造成
  但是soluble的部份也不全然是folding正確的
  (denature通常是會打斷雙硫鍵和氫鍵，若是ㄧ個蛋白質可以形成4個雙硫鍵，
   排列組合一下你就知道有多少種組合)
  所以這時就去測它的活性，或是用以之特性去證實
  (如A和B可以結合，那就用IP的方法去證實)
  當然少部分人是用CD去看，CD只看二級結構，所以不全然可信

  與其一直卡在這裡，我覺得就先確定是否有活性
  有的話就直接往下做了，別去管裡頭有多少比例是"正確的"protein



: ==========================細節說明討論發起線==================================
: 先感謝各位大大的回應
: 包含前面用水球丟了我好幾次的大大
: 我想就我的想法說明好了
: 確實
: 當"產量"夠的時候
: (產量定義為足夠我進行實驗的用量)
: 我確實是不需在乎aggregation的部分
: 但是當我產量不夠的時候
: 我必須額外再生產一批
: (不含等待的純工作天約14天)
: 因此小弟在評估從沉澱中將aggregation作denature並使其refolding
: 這樣的方式在時間上以及程序上是否比較有利?
: 然
: 我的實驗室並沒有人做過這樣的實驗
: 我想問的是
: 博士後認為我必須將urea處理的沉澱
: 與上清液的正常蛋白分開處理
: 因為他覺得refolding miss的機會很大
: 所以認為我必須分開處理後再以CD或其他方式去鑑定結構

  很正確


: 但我認為
: 我知道refolding miss的機會存在
: 但也不能否定正常foding蛋白的存在
: 同時
: 我實驗用的蛋白其Apo-,Holo-兩種構型僅有些許不同
: PI值分別為3.2, 3.3
: PI值差距這麼小的情況下能夠以Q-sepharose分離
: 那麼
: folding miss的蛋白我認為應該也能夠被分離
: 既然能被分離
: 那為何我還必須獨立處理這個部分呢?
: 這個部分是我最想知道的
: 感謝各位囉^_^

你的意思是不分離沉澱的部份嗎？

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  http://www.wretch.cc/album/aggaci

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 140.114.100.165
推 ronall:我想要將沉澱以飽和尿素作dearrregation後透析除掉尿素，
→ ronall:然後將它與原始上清液合併後繼續做EK反應，再以管柱分離
→ ronall:喔~抱歉~忘了說，我是做突變蛋白的，所以沒有活性的問題，
→ ronall:只有產量與結構正確與否的問題<(_ _)>
推 aggaci:ㄜ..其實你的第一句我看不懂....=..=|||
推 ronall:喔~這樣說好了!我將沉澱以尿素處理後，它能被尿素溶解
推 content71:那這樣就是CD了，我贊成你家博後的說法
推 aggaci:你的方法可行，但收集多點沉澱吧
推 rivis:因為是做突變蛋白，所以更要注意結構問題
→ rivis:不然投稿時，reviewer會質疑你突變後失去活性
→ rivis:是因為refolding後結構改變而造成的失活，與你的點突變無關
→ rivis:到時你解釋不了，整篇都得重來
→ rivis:我的看法是，refolding是下下策
→ rivis:除非你是不在乎結構，只要有活性就可以，也不重要
→ rivis:才考慮denature與refolding，否則只是自找麻煩
→ rivis:建議從少少的soluble部分去做還比較可行
→ rivis:不然就換表現系統